植物生物技术讲稿Word格式文档下载.docx
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植物组织培养（或细胞工程）PlantTissueCulture
基因克隆与转基因植物生产GeneCloningandGeneticallyModifiedCrops（GMcrops）
分子标记及辅助育种应用MolecularmarkersandMAS
•植物生物技术发展趋势：
从“投入特征”的作物向“产出特征”的作物转变
•植物生物技术的农业应用：
创造新材料；
培育新品种；
开发功能食品；
快速繁殖稀有材料；
材料的指纹分析、新基因挖掘、定位、辅助育种等。
五、植物生物技术与传统农业技术的关系
•传统农业技术在农业生产中仍将发挥主导作用，不可用生物技术全面替代。
如新品种选育。
•生物技术与传统技术结合可以加速研究进程
•生物技术可以大幅度提高农产品的附加值
•生物技术产品的出现使大批农业公司被生物技术公司替代，使农业经营领域发生变革
思考题：
生物技术的概念及其涵盖的内容；
植物生物技术包括那几个方面；
生物技术与农业生产的关系。
参考书：
•植物细胞组织培养，刘庆昌主编，中国农业大学出版社，2003
•作物DNA标记辅助育种，方宣钧主编，科学出版社，2001
•植物基因工程原理与技术，王关林主编，最新版？
，科学出版社
•农业生物技术学报；
科学通报；
中国科学C；
植物学报；
遗传学报；
植物生理与分子生物学学报；
实验生物学报;
生命科学研究；
科学导报
•TrendsinBiotechnology；
TrendsinPlantScience；
TrensgenicResearch；
PlantCell，TissueandOrganCulture；
PlantScience；
InvitroCellular&
DevelopmentalBiology;
TAG；
PlantBreeding；
Euphytica
第一章植物组织培养的原理与方法
5学时
通过该章教学，让学生掌握植物组织培养所涉及的基本概念；
培养基的组成、特点和用途；
植物组织培养实验室建设；
无菌操作的原理与技术等。
学习后，应能独立设计组织培养实验室，能够进行无菌操作，能够独立配制培养基。
第一节植物组织培养实验室建设
一、植物组织培养实验室的设置
标准的植物组织培养实验室必须具备下列必需的设施：
（1）清洗和贮存玻璃器皿、塑料器皿和其它实验器皿；
（2）培养基的配制、灭菌和贮存；
（3）植物材料的无菌操作；
（4）可控温度、光照、湿度的条件，以便对材料进行体外培养；
（5）培养物生长发育过程的显微观察
1、洗涤室：
主要用于清洗各种器皿、培养瓶（皿）的烘干，需要与洗涤有关的各种小工具、凉干架、烘箱等。
灭菌设备可以安装在该室。
2、培养基室：
各种药品、母液的储存，培养基的配制与分装。
需要试剂瓶、pH计、冰箱、天平、微波炉、水浴锅等。
3、接种室：
用于植物材料的无菌操作。
接种室为密闭式，用紫外线灯进行空气消毒。
接种室的主要仪器设备是超净工作台和操作台（用于放置培养基）。
4、培养室：
培养室是存放接种有植物材料的培养瓶的地方。
培养室的温度必须是可控的，一般是用空调或热风机使温度保持在25±
2℃。
植物组织培养要求一定的光照，采用日光灯源，一般光照强度为1000~4000lux。
培养室的湿度应控制在相对湿度80%左右，当培养室的相对湿度降到50%以下时，应采取措施增加湿度，以免培养基变干。
在培养室内应设有若干培养架以放置培养物。
培养架大小一般为1200mm×
600mm×
400mm。
培养室的主要设备是培养架、控温控光系统、摇床等。
二、植物组织培养实验室的主要仪器设备
（一）洗涤设备
一般应有一个洗涤室,专供洗涤及洗净培养瓶的储藏.
（二）灭菌设备
高温高压灭菌
物理灭菌干热灭菌
射线照射灭菌
1.灭菌种类 过滤灭菌
熏蒸灭菌
化学灭菌
消毒液灭菌
2.灭菌方法
（1）高温高压灭菌
原理:
将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内，在1210C高压和每平方厘米1个大气压下，一般持续15~20’，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子，适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。
灭菌操作：
灭菌需要的时间与物品有关：
含有20-50ml培养基的试管或三角瓶，1210C，20’
含有50-500ml培养基的三角瓶，1210C，25’
含有500-5000ml培养基的三角瓶，1210C，35’
空试管、瓶、滤纸等，1210C，30’
高温高压灭菌后可能会出现如下问题,需要引起注意:
1.pH值下降0.3-0.5单位;
2.太高温度灭菌时会使糖焦化,可能会产生毒性;
3.灭菌时间太长会使盐沉淀,同时使琼脂解聚;
4.挥发性物质不能高温灭菌,否则会被破坏.
（2）过滤灭菌法
原理：
将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45µ
微孔滤器装置,使液、气体通过滤膜流入无孔瓶中。
此法主要用于不能利用高温高压灭菌的培养基成分
灭菌操作：
不能高温高压灭菌的物质：
多糖Saccharose；
Colchicine；
Zeatin；
GA（95%失活）；
VB1、VB12、Vc、泛酸；
Antibiotics；
Plantextracts；
Enzymes
（3）化学灭菌法
主要用于植物材料的消毒，所用浓度、消毒时间因不同材料而定，应灵活运用并不断总结经验。
（三）化学实验设备
主要用于培养基的配制、分装与灭菌，化学试剂的配制，蒸溜水的生产，接种材料的准备、生化分析等
主要设备有：
实验台、水槽、凉干架、冰箱、药品柜、电炉或微波炉、天平、搅拌器、离心机、蒸溜器、pH计、各种玻璃器皿（量筒、烧杯、试剂瓶、移液管、容量瓶、三角瓶、培养皿、parafilm、滴管等）
（四）无菌操作设备
首先应具备一个无菌操作室,保持清洁,装有紫外灯。
室内设备：
放物台、超净工作台、各种接种工具
（五）培养设备
自动控温控光系统
培养室培养架
摇床
材料培养处
调温培养箱
培养箱调温调湿培养箱
光照培养箱
（六）细胞学观察设备
主要是显微镜系统，成像系统等。
包括倒置显微镜、荧光显微镜、研究显微镜、体视显微镜、CCD、计算机等。
第二节培养基的配制
培养基：
含有各种被培养生物材料生长所需要的营养成分的培养基质。
一、培养基的成分
培养基中包括植物生长必需的15种营养元素和某些生理活性物质，可概括为三大类：
（1）无机营养物
无机元素在植物生长发育中非常重要，镁（Mg）是叶绿素分子的一部分，钙（Ca）是细胞壁的组分之一，氮（N）是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分。
此外，铁（Fe）、锌（Zn）和钼（Mo）等是某些酶的组成部分。
植物除了碳（C）、氢（H）和氧（O）外，已知还有12种元素对于植物的生长是必需的，它们是氮（N）、磷（P）、硫（S）、钙（Ca）、钾（K）、镁（Mg）、铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌、硼（B）和铝（Al）。
其中前6种元素需要的数量较大，因此称之为大量元素或主要元素。
后6种元素需要的数量较小，因此称为微量元素或次要元素。
按照国际植物生理协会的建议，植物所需要的浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素，小于0.5mmol/L的元素为微量元素
（2）有机营养成分
主要包括碳源（糖类）和维生素类。
虽然大多数培养物都能合成所有必需的维生素，但合成能力有限，其数量显然不足。
为了能使组织很好地生长，在培养基中常常必须补加几种维生素和氨基酸。
其中硫胺素（维生素B1）一般认为是一种必需的成分。
在其它各种维生素中，已知吡哆醇（维生素B6），烟酸（维生素B3），泛酸钙（维生素B5）和肌醇也都能显著地改善培养的植物组织生长状况。
为了促进某些愈伤组织和器官的生长，有时还使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物，如水解酪蛋白，椰子汁，玉米胚乳，麦芽浸出物，番茄汁和酵母浸出物等。
最常用的碳源是蔗糖，使用浓度为2%~5%。
碳源除了作为植物生长发育所需的营养物质以外，另一重要的功能是调节培养基中的渗透压。
（3）植物生长调节物质
主要是细胞分裂素和生长素，有时也用GA3。
生长素：
生长素影响到植物茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。
在离体植物组织培养中，生长素被用于诱导细胞分裂和根的分化。
在植物组织培养中常用的生长素有：
IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、P—CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）和2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）。
其中IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖。
2，4-D和2，4，5-T对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。
生长素一般溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好。
细胞分裂素：
细胞分裂素影响植物细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。
培养基中加入细胞分裂素，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽。
比较常用的细胞分裂素有：
BAP（苄氨基嘌呤）、6—BA（苄基腺膘呤）、2—ip（异戊烯氨基嘌呤）、KT（激动素，呋喃氨基嘌呤）和ZT（玉米素）。
细胞分裂素一般溶于0.5或1mol/L的HCl或NaOH中。
二、培养基的种类和特点
目前发展出的培养基有几十种，但常用的有MS、B5、white、N6、KM8P、SH等。
MS的无机盐和离子浓度较高，养分平衡，是目前使用最多的培养基
B5的主要特点是含有较低的铵，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用
white的特点是无机盐数量较低，适于生根培养
KM8P主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸。
N6主要用于花药培养，其特点是成分简单，且KNO3和（NH4）2SO4含量高。
三、培养基的配制
1.母液的配制
配制母液有两个好处:
可减少每次配制称量药品的麻烦;
减少极微量药品在每次称量时造成的误差,一般需准备四种母液:
A）大量元素母液:
可配成10倍母液,用时每配1000ml培养基取100ml母液。
配制母液时应注意：
分别称量；
充分溶解；
注意混合秩序：
Ca++应最后加入，与SO42-和HPO42-错开，以免产生沉淀；
混合时要缓慢，边搅拌边混合。
B）微量元素母液
因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，每配1000ml培养基取10ml或1ml，注意的原则同大量元素。
C）铁盐母液
必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀。
一般采用螯合铁，即硫酸亚铁与EDTA钠盐的混合物。
一般扩大200倍，每配1000ml培养基取5ml，EDTA钠盐需用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75-800C之间让其螯合1小时。
使用螯合铁的目的：
避免沉淀；
缓慢不断地供应铁。
D）有机化合物母液
主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，浓度为每毫升含0.1,1,10mg,使用时根据需要量取。
E）激素
每种激素必须单独配成母液，其浓度为0.1,0.5或1.0mg/ml,多数激素难溶于水，配法如下：
IAA、IBA、GA3先溶于少量酒精，再加水定溶至一定刻度
NAA可溶于热水或少量酒精中，再加水定溶至一定刻度
2，4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后再定溶
KT和BA先溶于少量1molHCl中，再加水定溶
玉米素先溶于少量95%酒精中，再加水定溶。
2.培养基的配制
–称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水直到培养基最终容积的3/4，在恒温水浴中加热使之溶解。
在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温的水中也可以溶解。
–分别按配方逐个加入各种贮备液，包括生长调节物质和其他的特殊补加物。
–加蒸馏水直至培养基的最终容积。
–充分混合之后，用0.1mol/LNa0H和0.1mol/LHCl调节培养基的pH。
一般来说，植物组织培养适合的pH值为5.8，当pH高于6时，培养基将会变硬，低于5时，琼脂就不能很好地凝固。
–把培养基分装到所选用的培养容器中，每个25×
150mm的试管约装培养基15m1；
每个150ml三角瓶约装50ml。
–封口
–灭菌
–对于不能用高压灭菌的药品来讲，经过滤灭菌后的药液等到高压灭菌的培养基冷却到大约60℃时，在超净工作台加入到培养基中，摇匀。
–
第三节离体无菌操作技术
一、植物材料的消毒
接种前必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功的根本保证。
取材应注意的事项：
1.从健壮株上取材,不要有伤口
2.严格防治病虫
3.要在晴天取,最好中午或下午取材,不要在雨天、阴天或露水未干十取材料
4.最好避开选用田间材料,选用无菌苗
5.若非要用田间材料,最好将材料种在大棚里（无雨水的地方）或生长箱里.
一些常用的植物材料消毒剂有:
HgCl2、次氯酸钠等。
对于难消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等，在消毒前，一般先用肥皂水洗净，自来水冲净，再在70%酒精或1N盐酸中浸30’再进入消毒剂，消毒剂中可加数滴吐温20，以增强消毒剂的效果。
二、无菌操作
开始操作前要用70%酒精消毒手和前臂。
为保证做到无菌操作，除实验中所用物品需事先消毒外，在实验中还要保持无菌操作。
因此在进行实验前，要点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。
但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火。
烧灼过的器械要冷却后才能使用工作台面上的用品要放置有序、布局合理。
酒精灯在当中，右手使用的物品在右侧，左手用品在左侧。
工作忌忙乱而要有序；
组织、细胞及培养板在未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中，应分别使用不同吸管吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液，不能混用。
用吸管、注射器进行转移液体操作时，吸管、注射器针头、不能触及瓶口以防止细菌污染或细胞的交叉污染。
三、无菌培养
材料接种后应移入培养室培养，一般培养室要求非常卫生、恒温，有理想的光照控温系统，一般材料要求250C左右，晚上一般不应低于200C。
第四节组织培养术语
•愈伤组织（Callus，Calli，Calluses）：
愿意指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
•外植体（Explant）：
由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官
•脱分化（dedifferentiation）：
一个成熟细胞转变为分生状态的过程
•全能性（Totipotency）：
具有完整细胞核的植物细胞所拥有的形成完整植株的潜在能力
•再分化（Redifferentiation）：
脱分化的细胞在形成植物器官或植株的过程
•克隆（Clone）：
在植物细胞培养中，克隆指单一细胞有丝分裂形成的细胞群体，也指通过无性繁殖而形成的植株群体。
•诱导（Induction）：
体外培养植物材料时，细胞分裂的启动及结构、器官等的诱发
•体细胞克隆：
由单一体细胞形成的细胞群体
•配子细胞克隆：
由单一配子细胞形成的细胞群体
•灭菌与消毒：
灭菌（Sterilization）指消除实验设备或材料上的所有微生物；
消毒（Disinfection）：
仅指消除可能造成污染或侵染的有机体。
1．掌握本章讲述的概念和名词，要求理解并记忆
2．如何理解植物细胞的全能性？
3．灭菌的方法包括哪两类，每类包括写什么方法，基本原理是什么？
4．哪些物质不能该温高压灭菌？
5．常用的培养基有哪几种，每种培养基的特点？
6．培养基的营养成分分为哪几大类？
大量元素和微量元素是如何划分的，其中大量元素包括哪集中？
各种激素的溶解方法？
7．为什么要配制培养基的母液？
配制母液时应注意那些事项？
为什么铁盐使用螯合铁？
8．为了保证消毒彻底，从自然条件下取外植体时应注意什么问题？
第二章胚胎培养
2学时
要求掌握胚培养、胚珠培养和胚乳培养的意义，尤其是在育种工作中的实用价值。
胚培养的概念：
植物胚胎培养是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术。
胚是遗传物质从上代向下代传递的重要载体，在种植业生产中具有重要意义。
第一节胚培养
一、胚培养的意义
1、克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性，获得种间或属间杂种
植物胚培养的最大用途是用以获得种间或属间杂种。
在很多种间和属间杂交中，受精作用能正常完成，胚也能进行早期的发育，但由于胚乳发育不良，杂种胚最终将会夭折，因而不能形成有发芽能力的种子。
在这类难以成功的杂交中，杂种胚常常具有正常生长的潜力，若把杂种胚夭折以前置于某种合适的培养基上培养，则能获得杂种植株。
2.研究合子胚的胚胎发育
离体培养的胚胎发育主要与三个因素有关:
接种时胚体的大小,培养基的成分,接种前在胚珠中停留的长短。
如果接种的是球形胚，就会形成很多不正常胚，因为胚越小，对培养基的成分越敏感；
如果接种的是心形或心形期以后的胚，胚的发育与体内发育相似。
3.克服种子休眠，提早结实
植物休眠从几天到几年不等。
某些园艺植物如落叶树的育种和繁育工作因种子休眠期太长而受到影响。
休眠的种子在给于合适的温度、氧气和湿度条件也不能萌发，而应用胚培养常常可以克服这一类种子发育上的障碍，促进胚的生长发育。
通过胚的离体培养，可使休眠期缩短。
苹果属的一些品种，种子播种后在土壤中需几个月才能萌发，离体培养的胚却能在48h萌发，4周内形成移植幼苗，5个月的幼苗长达1m高。
4.获得单倍体植株
单倍体的产生方法很多，通过远缘杂交，结合胚培养技术是获得单倍体的有效方法之一。
栽培大麦与球茎大麦进行杂交，受精作用几乎完全正常，但由于二者的细胞分裂周期不同，合子胚在经过几次有丝分裂以后，球茎大麦的染色体被淘汰，子细胞中只留下大麦的染色体，为大麦单倍体。
5.缩短育种周期，提高育种效率
在育种实践中，为了加快育种进程，可采用离体胚培养的方法。
例如蔷薇属植物的栽培品种常需1年才能开花。
从离体培养胚获得的幼苗只需2~3个月即可开花，而利用这种花作父本，1年内可产生2个世代，大大地提高育种进程。
6.稀有植物的繁殖（使种子无生活力或胚发育不全的植物获得后代）
许多落叶果树的种子是早熟的,种子往往不育。
用胚胎培养可以将不能正常萌发的种子培养出第二代植物。
兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6~7个细胞，多数胚不能成活。
如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植株。
椰子（Cocosnucifera）的胚乳是液体的，为液体胚乳。
有一种变异类型，它们的椰子不能形成液体胚乳，取而代之的是一种柔软肥厚的组织。
这些果实被称做“Makapuno”。
因这种变异类型的种子不能繁殖，故“Makapuno”十分稀罕，价格非常昂贵，在菲律宾只有盛大宴会才供应这种果实。
应用离体胚培养技术，将“Makapuno”的种胚进行离体胚培养已成功地由“Makapuno”种子获得了植株，且85%后代所结的果实均是“Makapuno”。
二、胚培养技术
1．自然条件下胚的发育
2．离体培养条件下胚的发育
3．胚培养操作技术
三、胚培养的影响因素
1、胚龄
一般说来，胚龄大小与成活率成正相关。
离体胚培养时，胚的发育有以下几种可能性途径：
（1）胚胎发育途径：
幼胚经过心形期，再发育到鱼雷形期，进而进入子叶期，最后萌发成苗。
这是幼胚培养成功的途径。
（2）早熟萌发途径：
幼胚从心形期发育到鱼雷形期后，不经过子叶期直接发育成苗，即跳过某一个发育阶段，这样的幼苗往往很弱小，组织不健全，且难于培养成正常的植株。
（3）产生愈伤组织：
幼胚培养过程中细胞脱分化产生愈伤组织。
通过幼胚培养产生的愈伤组织，经植株再生同样可得到远缘杂种。
据报道，由胚培养产生的愈伤组织较其它外植体容易得到再生植株。
（4）停止生长或幼胚死亡。
非常小的幼胚进行培养时，接种后常遇到细胞生长停滞，如不采取一些拯救措施，幼胚细胞即死亡。
2、培养基
成熟胚培养只要求含有无机营养元素、几种维生素和少量激素的基本培养。
而未成熟胚一般不能在这类简单培养基上生长，它们比成熟胚对营养的要求更为复杂，除了无机和有机营养、维生素、氨基酸、激素外，胚乳的看护对于幼胚培养十分重要。
3、培养条件
温度：
大多数植物的离体胚培养温度为25℃~30℃。
不同的植物类型对其温度要求也不相同。
起源于低纬度地区的喜温植物要求较高的温度，而起源于高纬度地区的耐低温植物所需的温度相对较低。
光照：
光对于某些植物胚胎的生长并不很重要，但对某些植物胚却有很大影响。
主要表现在光能抑制未成熟胚的早熟萌发。
第二节胚珠培养
一、胚珠培养的用途
•成熟胚很小时，胚培养难以成功，采用胚珠培养较易成功。
Maheshwari将授粉5天的罂粟（Papaversomnierum）胚珠进行离体培养，得到种子。
罂粟授粉5天的胚珠仅为合子胚或只有2个细胞的原胚。
•对未受精的胚珠进行培养可诱发大孢子发育成单倍体植物。
•在棉花种间杂交中，通过胚珠培养可以防止由于棉铃脱落
丧失杂种胚。
•研究棉花的纤维发育
二、培养方法
取回花蕾,去除苞叶、萼片，将子房消毒，无菌状态下取出胚珠，接种于培养基中。
三、影响胚珠培养成功的因素
培养基的基本组成
（1）培养条件 激素
有机成分
（2）胚的发育
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