植物DNA的提取Word文档下载推荐.docx

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②SDS提取缓冲液

100mM/LTris.ClpH8.0

100mM/LNaCl

50mM/LEDTA

2%SDS

2．1×

TE：

10mMTris.ClpH8.0；

1mMEDTApH8.0

3．3MNaAcpH5.2；

预冷的异丙醇

仪器：

水浴锅、离心机、

操作步骤：

操作步骤

①植物叶片2-3g在液氮中研磨,装入2ml离心管中。

②加800ul提取缓冲液,充分混匀。

③65℃水浴60min。

④加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1）,充分混匀。

⑤6000rpm离心20min。

⑥取上清,加等体积的氯仿/异戊醇（24:

1）,充分混匀。

⑦6000rpm离心20min。

⑧取上清,加1/10体积的3M/LNaAc（pH5.2）,0.8×

体积预冷的异丙醇,混匀,置-20℃一小时。

⑨勾出或10000rpm离心,沉淀DNA。

⑩70%酒精洗沉淀2次。

⑾风干DNA样品,加适量TE溶解DNA,置-20℃备用。

作业：

1．分离与提取植物总DNA的原理是什么？

2．用CTAB方法制备植物DNA的操作过程中应注意那些事项？

实验3DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过糖苷键交替构成的线状聚合物，形成直径为50nm到200nm的三维筛孔通道。

在电场作用下，DNA分子在琼脂糖中迁移。

通过EB染色可以检测DNA的分子大小及质量，可定量、定性地对通过DNA分子进行分析。

1．10XTBE（电泳缓冲液）（108gTris，55g硼酸，40ml0.5mol/LEDTA）

2.6X加样缓冲液（0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液）

3．琼脂糖

4．溴化已锭（EB）

DNA材料：

CTAB或其他方法制备的植物总DNA

电泳槽、电泳仪

检测经提取的DNA质量。

方法步骤：

1用胶带封住塑料托盘的两边。

2配置足量的0.5XTBE，倒入电泳槽中。

3称取0.8g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml0.5XTBE,加热融化,加热时防止溶液溢出。

4待温度降至55℃时，加入EB，使终浓度为0.5ug/ml（略）。

5插好梳子。

6将胶倒入托盘，倒入时防止产生气泡。

7待凝胶完全凝结后，拔出梳子，放入电泳槽。

8DNA样品与6X上样缓冲液混合。

9上样。

10接好电源，调整电压为100V，电泳1小时。

11关掉电源，取出凝胶，在凝胶成像系统下观察，或用手提紫外灯下观察。

1.琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的原理是什么？

2.写出琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的实验流程。

实验2目的DNA分子的PCR扩增

1实验原理

1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成

PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2+等。

（1）模板DNA的变性

模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。

（2）模板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。

退火时间一般为1～2min。

（3）引物的延伸

DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。

延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。

1.2PCR反应的五个元素

参与PCR反应的物质主要为五种：

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

引物：

引物设计应遵循以下原则：

（1）引物长度。

长度要求在15～30bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；

引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。

（2）引物碱基构成。

引物的G+C含量以40～60%为宜，因为G+C含量过高或过低都会直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3）引物二级结构。

应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3’端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。

引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。

（4）引物3’端序列。

3’端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

（5）引物中酶切位点的引入。

引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。

（6）引物的特异性。

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。

（7）引物量。

反应体系中引物的常用浓度为0.1～1pmol/μl，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。

酶及其浓度

TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。

具有5’-->

3的聚合酶活力，5’-->

3’的外切核酸酶活力，无3’-->

5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。

此酶具有以下特点：

（1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2小时后为原来的40%。

（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。

（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。

一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u（总反应体积为50μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度

在PCR反应中，dNTP应为50～200μmol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

模板DNA

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；

蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。

模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/μl，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。

在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。

Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

1.3PCR反应条件

温度与时间的设置：

标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。

1.4PCR反应特点

（1）强特异性

PCR反应的特异性决定因素为：

A.引物与模板DNA特异性的结合；

B.碱基配对原则；

C.TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

D.靶基因的特异性与保守性。

（2）高灵敏度

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6g）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；

在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；

在细菌学中最小检出率为3个细菌。

（3）快速简便

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性－退火－延伸反应，反应一般在2～4小时完成。

扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。

（4）低纯度模板

DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

1.5PCR结果异常分析

（1）非特异性扩增产物的出现

A.背景DNA与引物同源性高。

可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对对扩增产物DNA再次进行PCR扩增。

B.退火温度太低。

引物和模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。

退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解离不下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异性的产物DNA。

提高退火的温度将可改善结果。

C.过量的酶、引物和模板DNA可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异性产物DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。

（2）无特异性扩增产物带

A.引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。

B.模板DNA制备时模板已降解。

C.Taq酶有失活或有杂酶污染。

D.缓冲液条件不当。

E.引物不正确。

2实验目的：

通过该实验了解PCR反应原理，掌握PCR操作的基本步骤以及对PCR反应结果的分析。

3试剂与器材

1）.试剂

（1）模板DNA

（2）TaqDNA聚合酶

（3）10×

缓冲液

（4）dNTP（2.5mM）

（5）Primer1（10pmol/μl）

（6）Primer2（10pmol/μl）

2）.器材

（1）eppendorf管PCR专用薄壁管（200μl）

（2）枪头

（3）移液器

（4）离心机PCR反应液混合后离心

（5）PCR仪

（6）超净工作台提供洁净操作区用于PCR加样

4实验步骤

（1）按如下体积加样进行PCR反应：

1#2#

总体积50μl50μl

ddH2O28.5μl26.5μl

10×

buffer（含Mg2+）5μl5μl

dNTP（2.5mM）4μl4μl

Primer1（10pmol/μl）5μl5μl

Primer2（10pmol/μl）5μl5μl

染色体DNA2μl4μl

Taq酶（5U/μl）0.5μl0.5μl

（2）充分混匀后按下列条件进行反应：

95℃5min

95℃30s

57℃1min30个循环

72℃1min

72℃5min

4℃10hs

（3）取40μl采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况。

5作业

1）简述PCR反应的基本原理。

2）分析PCR反应体系中各成分对扩增结果的影响。