植物DNA的提取Word文档下载推荐.docx

1、 SDS提取缓冲液 100 mM/L Tris.Cl pH 8.0 100 mM/L NaCl 50 mM/L EDTA 2 % SDS21TE： 10 mM Tris.Cl pH8.0；1 mM EDTA pH8.033M NaAc pH 5.2 ；预冷的异丙醇仪器：水浴锅、离心机、操作步骤：操作步骤 植物叶片2-3g在液氮中研磨, 装入2ml 离心管中。 加 800ul 提取缓冲液, 充分混匀。 65水浴 60 min。 加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）, 充分混匀。 6000rpm离心20min。 取上清, 加等体积的氯仿/异戊醇（24:1）,充分混匀。 6000rpm离心2

2、0min。 取上清, 加1/10 体积的3M/L NaAc （pH5.2）, 0.8 体积预冷的异丙醇, 混匀, 置-20 一小时。 勾出或 10000rpm 离心, 沉淀DNA。 70% 酒精洗沉淀2次。 风干DNA样品, 加适量TE溶解DNA, 置-20 备用。作业：1分离与提取植物总DNA的原理是什么？2用CTAB方法制备植物DNA的操作过程中应注意那些事项？实验3 DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过糖苷键交替构成的线状聚合物，形成直径为50nm到200nm的三维筛孔通道。在电场作用下，DNA分子在琼脂糖中迁移。通过EB染色可以检测DNA的分子大小及质量，可定

3、量、定性地对通过DNA分子进行分析。1 10X TBE（电泳缓冲液）（108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA）2. 6X 加样缓冲液 （0.25% 溴酚蓝,40% 蔗糖水溶液）3 琼脂糖 4 溴化已锭（EB）DNA材料：CTAB或其他方法制备的植物总DNA 电泳槽、电泳仪检测经提取的DNA质量。方法步骤：1 用胶带封住塑料托盘的两边。2 配置足量的0.5X TBE，倒入电泳槽中。3 称取0.8g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml 0.5X TBE, 加热融化, 加热时防止溶液溢出。4 待温度降至55时，加入EB，使终浓度为0.5ug/ml（略）。5 插好梳子。6

4、 将胶倒入托盘，倒入时防止产生气泡。7 待凝胶完全凝结后，拔出梳子，放入电泳槽。8 DNA样品与6X上样缓冲液混合。9 上样。10 接好电源，调整电压为100V，电泳1小时。11 关掉电源，取出凝胶，在凝胶成像系统下观察，或用手提紫外灯下观察。 1. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的原理是什么？ 2. 写出琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的实验流程。实验2 目的DNA分子的PCR扩增1 实验原理1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微

5、量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。（1）模板DNA的变性模板DNA加热到9095时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。（2）模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至3765时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火时间一般为12min。（3）引物的延伸DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。延伸所需要的时间取决于模

6、板DNA的长度。1.2 PCR反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物设计应遵循以下原则：（1）引物长度。长度要求在1530bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。（2）引物碱基构成。引物的G+C含量以4060%为宜，因为G+C含量过高或过低都会直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（3）引物二级结构。应尽量避免引物内部出现二级结构，

7、并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。（4）引物3端序列。3端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。（5）引物中酶切位点的引入。引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。（6）引物的特异性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。（7）引物量。反应体系中引物的常

8、用浓度为0.11pmol/l，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。酶及其浓度Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力，无3-5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-410-5。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95下反应

9、2小时后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u（总反应体积为50l时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度在PCR反应中，dNTP应为50200mol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板DNA模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关

10、键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在110ng/l，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特

11、异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中， Mg2+浓度为1.52.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。1.3 PCR反应条件温度与时间的设置：标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。1.4 PCR反应特点（1）强特异性PC

12、R反应的特异性决定因素为：A. 引物与模板DNA特异性的结合；B. 碱基配对原则；C. Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；D. 靶基因的特异性与保守性。（2）高灵敏度PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（g = 10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。（3）快速简便PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性退火延伸反应，反应一般在24小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广

13、，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。（4）低纯度模板DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。1.5 PCR结果异常分析（1）非特异性扩增产物的出现A. 背景DNA与引物同源性高。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对对扩增产物DNA再次进行PCR扩增。B. 退火温度太低。引物和模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解离不下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程

14、就可扩增出非特异性的产物DNA。提高退火的温度将可改善结果。C. 过量的酶、引物和模板DNA可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异性产物DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。（2）无特异性扩增产物带A. 引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。B. 模板DNA制备时模板已降解。C. Taq酶有失活或有杂酶污染。D. 缓冲液条件不当。E. 引物不正确。2实验目的：通过该实验了解PCR反应原理，掌握PCR操作的基本步骤以及对PCR反应结果的分析。3 试剂与器材1）. 试剂 （1）模板DNA （2）Taq DNA聚合酶 （3）10缓冲液 （4）dNTP（2.5mM） （5）Pri

15、mer1（10pmol/l） （6）Primer2（10pmol/l）2）. 器材 （1）eppendorf管 PCR专用薄壁管（200l） （2）枪头 （3）移液器 （4）离心机 PCR反应液混合后离心 （5）PCR仪 （6）超净工作台 提供洁净操作区用于PCR加样4实验步骤（1）按如下体积加样进行PCR反应： 1# 2# 总体积 50l 50l ddH2O 28.5l 26.5l 10buffer（含Mg2+） 5l 5l dNTP（2.5mM） 4l 4l Primer1（10pmol/l） 5l 5l Primer2（10pmol/l） 5l 5l 染色体DNA 2l 4l Taq酶（5U/l） 0.5l 0.5l（2）充分混匀后按下列条件进行反应： 95 5min 95 30s 57 1min 30个循环 72 1min 72 5min 4 10hs（3）取40l采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况。5 作业1）简述PCR反应的基本原理。2）分析PCR反应体系中各成分对扩增结果的影响。