血红蛋白的提取和分离Word下载.docx

血红蛋白的提取和分离Word下载.docx

《血红蛋白的提取和分离Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血红蛋白的提取和分离Word下载.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

对蛋白质研究有助于人们对生命过程认识和理解。

所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。

怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

1．基础知识

蛋白质物化理性质：

形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：

（图5－13a）分子量大分子通过多孔凝胶颗粒间隙，路程短，流动快；

分子量小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

（图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：

从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子差速流动。

1．2缓冲溶液

由弱酸和相应强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐用量，可配制不同pH缓冲液。

（2）缓冲液作用：

抵制外界酸、碱对溶液pH干扰而保持pH稳定。

1．3凝胶电泳法：

不同蛋白质带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读教材后，填写下表：

决定运动方向

形成库仑力

形成阻力

决定运动速率

电荷性质

√

电荷量

分子形状

分子大小

（2）分离方法：

琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；

加入带负电荷多SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

2．实验设计

2.1蛋白质提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：

是否所有种类蛋白质提取和分离都是这样？

为什么？

不是。

因为蛋白质来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？

哺乳动物血液。

因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。

并思考回答下列问题：

血液由和两部分组成。

血细胞中细胞数量最多，细胞含量最高化合物是。

该化合物是由和构成，其中每个亚基中都含有一个能和O2和CO2结合基团。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白过程为：

洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。

洗涤红细胞目是什么？

除去血浆蛋白杂蛋白，有利于后续步骤分离纯化。

红细胞洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

加入柠檬酸钠有何目？

为什么要低速、短时离心？

为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；

防止白细胞沉淀；

防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

你有什么方法将红细胞中血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：

加入蒸馏水后红细胞液体积和原血液体积要相同。

加入甲苯目是溶解细胞膜，有利于血红蛋白释放和分离。

此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。

怎样除去这些杂质呢？

由于它们密度不同，科学家采取了离心分离方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×

10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？

。

透析。

半透膜选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7磷酸缓冲液中。

为何使用pH＝7磷酸缓冲液？

为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白正常特性。

有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：

通过以上四个基本过程，红细胞中血红蛋白就被提取出来。

但其中还含有其他种类蛋白质分子（如呼吸酶等）。

怎样将杂蛋白和血红蛋白分离开来呢？

我们来研究蛋白质提取和分离第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：

制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱制作过程：

准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步――凝胶色谱柱装填。

请阅读教材：

色谱柱装填过程。

步骤

操作要求

①

色谱柱垂直固定在支架上

②

计算称量凝胶

根据色谱柱体积计算凝胶用量

③

配制悬浮液

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

④

装填悬浮液

一次性缓慢倒入；

轻轻敲打

⑤

缓冲液洗涤平衡

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h

样品加入和洗脱。

其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到粗分离。

在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）红细胞洗涤：

洗涤次数不能过少；

低速、短时离心。

（2）凝胶预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；

无气泡；

洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：

红色区带均匀一致地移动。

（三）课堂总结、点评

（四）实例探究

例1利用凝胶色谱法，什么样蛋白质先洗脱出来（）

A.相对分子质量大

B.溶解度高

C.相对分子量小

D.所代电荷多

解析：

凝集色谱法使根据相对分子质量大小分离蛋白质有效方法。

相对分子质量较小蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；

相对分子质量大蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。

答案：

A

例2蛋白质提取和分离分为哪几步（）

A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

蛋白质提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。

A中凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中技术

C

☆综合应用

例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大蛋白质（）

A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快

在小球体内部有许多贯穿通道，当相对分子质量不同蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；

而相对分子质量较大蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

D

（五）巩固练习

1.凝胶色谱法分离蛋白质依据是（）

A.对其他分子亲和力

B.溶解度

C.所带电荷多少

D.相对分子质量大小

2.凝胶色谱法中所用凝胶化学本质大多是（）

A.糖类化合物

B.脂质

C.蛋白质

D.核酸

3.选用红细胞作为分离蛋白质实验材料，有何好处（）

A.血红蛋白是有色蛋白

B.红细胞无细胞核

C.红细胞蛋白质含量高

D.红细胞DNA含量高

4.将搅拌好混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（）

A.甲苯

B.血红蛋白水溶液

C.脂溶性物质沉淀层

D.其他杂质沉淀

5.血红蛋白因含有（）而呈红色

A.O2B.COC.CO2D.血红素

6.下列操作正确是（）

A.分离红细胞时采用低速长时间离心

B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D.透析时要用20mmol/l磷酸缓冲液，透析12h

7.样品加入和洗脱叙述正确是（）

A.先加入1ml透析后样品

B.加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出

C.如果红色带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功

D.洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

8.下列有关提取和分离血红蛋白程度叙述错误是（）

A.样品处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B.通过透析可以去除样品中分子质量较大杂质，此为样品粗提取

C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大杂质蛋白除去，即样品纯化

D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

9.凝胶色谱法操作正确是（）

A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状凹穴

B.将橡皮塞下部切出凹穴

C.插入玻璃管上部要超出橡皮塞凹穴底面

D.将尼龙网剪成和橡皮塞下部一样大小圆片

10.样品加入和洗脱操作不正确是（）

A.加样前，打开色谱柱下端流出口，使柱内凝胶面上缓冲液缓慢下降到凝胶面下面

B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D.用吸管小心将1ml透析后样品加到色谱柱顶端，不要破坏凝胶面

1.D2.A3.A4.D5.D6.D7.C8.B9.A10.D

★课余作业

1、你能描述血红蛋白分离完整过程吗？

2、和其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？

这对你进行蛋白质分离和提取有什么意义？

★教学体会

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域进展，说明提取、分离高纯度蛋白质重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取基本技术。

教师可以发挥学生主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究新进展，激发学生学习兴趣，然后指出本课题学习意义，让薛生初步体会分离纯化蛋白质过程和方法

★资料袋

凝胶色谱法分离蛋白质原理

凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量大小分离蛋白质方法之一。

所用凝胶实际上是一些微小多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿通道，当一个含有各种分子样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同运动，即垂直向下运动和无规则扩散运动，相对分子质量较大蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过路程较短，移动速度较快；

相对分子质量较小蛋白质分子比较容易进入凝胶内通道，通过路程较长，移动速度较慢。

因此，样品中相对分子质量较大蛋白质先流出，相对分子质量中等分子后流出，相对分子质量最小分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。

此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大分子通过这种网状结构上空袭时阻力大，而相对分子质量小分子通过时阻力小，因此不同分子量蛋白质分子可以获得分离。