武义县高中生物实验技能提升培训二Word文件下载.docx
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Nameofspecies
染色体数目
Chromosome
number
基因组
Genome
分布
Distribution
栽培稻（O.sativaL.）
非洲栽培稻（O.glaberrima）
疣粒野生稻（O.meyeriana）
药用野生稻（O.officinalis）
宽叶野生稻（O.latifolia）
高杆野生稻（O.alta）
斑点野生稻（O.punctata）
栽培稻×
药用野生稻F1植株
BC1植株（栽培稻回交）
BC1植株（药用野生稻回交）
药用野生稻单体附加系（MAAL8）
24
48
36
25
AA
GG
CC
CCDD
BBCC
AC
AAC
ACC
AA+C
全世界
西非
南亚、东南亚
亚洲热带、亚热带、
澳大利亚热带
拉丁美洲
非洲
—
材料由华南农业大学卢永根院士、武汉大学何光存教授和李刚博士提供。
2主要的化学药品和试剂
实验中用到的主要实验药品见表3。
表3实验中主要的化学药品及试剂
名称
纯度
来源
乙醇
冰醋酸
盐酸溶液
果胶酶
纤维素酶
硫酸铁铵
氯化钠颗粒
柠檬酸钠
甘油
甲醇
磷酸二氢钠
磷酸二氢钾
氯化钾
柠檬酸
Giemsa粉
PI（碘化丙啶）
DAPI
生物素化dUTP
地高辛化dUTP
分析纯
生物纯
杭州长征化学试剂有限公司
杭州化学试剂有限公司
无锡市晨阳化工有限公司
Fluka公司
上海伯奥生物科技有限公司
湖州湖试化学试剂有限公司
中国医药（集团）上海化工有限公司
浙江杭州双林化工试剂厂
杭州萧山化学试剂厂
上海统亚化工科技发展有限公司
宁波市化学试剂厂
国药集团化学试剂有限公司
Sigma公司
Roche公司
华美生物工程公司
Roche公司
3主要仪器与设备
主要仪器与设备见表4。
表4实验中用到的仪器与设备
型号
制造商或产地
光照培养箱
SPX-250B-G
上海博讯实业有限公司医疗设备厂
4℃与-20℃冰箱
BCD-215K
海尔集团
恒温水浴箱
HH-4
金坛市杰瑞尔电器有限公司
架盘药物天平
HC-TP11-2
上海精密科学仪器有限公司
成像处理软件
PhotoshopCS5.0
美国
定性滤纸
GB/T1914-93
杭州新华纸业有限公司
干燥器
-
显微镜
荧光显微镜
XSP-2CA
OLYMPUSBX61
上海
日本
4主要试剂的配制
⑴卡诺固定液：
酒精：
冰醋酸=3：
1（体积比）混合，置4℃冰箱保存备用，作用是迅速杀死细胞，使之在形态上和内部结构上保持生活时的完整和真实状态，并且能将细胞在生活情况下不易观察清楚的结构清晰显现。
⑵对二氯苯饱和溶液：
实验室提供，作用是对根尖进行预处理，改变细胞质的粘度，抑制和破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散，有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数。
⑶1%盐酸溶液：
实验室提供，调pH。
⑷2%果胶酶和纤维素酶：
将果胶酶与纤维素酶1：
1混合，使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平。
⑸苏木精染液：
实验室提供，使染色体染上较深的颜色，分色清晰，照像效果较好，利于标本长期保存。
⑹硫酸铁铵：
实验室提供，在进行苏木精染色前进行媒染，使苏木精染色效果更好。
⑺2ⅹSSC：
Nacl粉末17.5g，柠檬酸钠粉末8.8g，加入100mlddH2O，于烧杯中搅拌使氯化钠，柠檬酸钠完全溶解，并混匀，置试剂瓶中保存。
⑻Giemsa染液：
Giemsa粉0.5g，甘油22ml，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒，然后将剩余的甘油混在一起，56℃保温2小时后，加入33ml纯甲醇，保存于棕色瓶内。
⑼Sorense缓冲液：
Na2HPO4（1/15M）50ml与KH2PO4（1/15M）50ml混匀，并测pH（pH=7.0左右），作用在于平衡pH值。
5实验方法
5.1紫景天染色体制片及观察
（1）插穗：
选择当年萌发枝，剪成6～7厘米长，带顶芽，粗插穗（0.6～0.8cm）。
用光照培养箱培养：
温度20℃，光照强度为2500lx（6时~19时），插床选用长方形72孔（6×
12）黑色育苗盘，每个孔的长×
宽×
高为4.5cm×
4.5cm×
5cm，进行生根培养。
室温培养：
插床选用长方形72孔（6×
5cm，在自然光和室温下进行生根培养。
水里培养：
放入装有自来水的容器中，在自然光和室温下进行生根培养。
（2）取样：
选取生长状况良好的根尖，切取0.5cm。
（3）预处理：
为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应对剪下的根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制和破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散。
预处理的方法有低温预处理和药物预处理。
低温预处理：
将剪取的根尖浸入盛有蒸馏水的烧杯内，置于4℃的冰箱中进行低温处理24小时，此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀。
药物预处理：
常用药物有秋水仙素溶液、对二氯苯溶液、8-羟基喹啉等。
（4）根尖的低渗：
低渗是为了使染色体更好的分散。
在固定前用0.075mol/LKCl室温下处理30分钟，酶解后用蒸馏水低渗15～30分钟，使染色体分散效果更好。
（5）固定：
新鲜3：
1甲醇：
冰乙酸的固定液固定2～3h或4℃过夜。
（借助于物理方法或化学药物的作用，迅速渗入组织和细胞将之杀死，使其形态结构和内含物尽可能保持生活时的完整和真实状态。
固定时，将预处理过的根尖用蒸馏水冲洗两次（约5分钟）。
然后移入卡诺氏固定液中，在4℃～15℃条件下固定20～24小时后用70％酒精冲洗2次转入70％酒精中。
在4℃冰箱内保存，保存时间最好不超过二个月。
经过较长时间保存的材料，进行观察前可以换用固定液再处理一次效果较好。
或将预处理过的根尖放入0.075mol/LKCl溶液中低渗20分钟，然后在蒸馏水中冲洗2～3次（约10分钟）待用。
（6）水洗：
每隔5分钟洗一次，洗净。
（7）解离：
2%纤维素酶、2%果胶酶、1%解析酶混合（2：
2：
1），28℃下处理4小时。
有酸解和酶解两种方法：
酸解：
将根尖从固定液中取出，用蒸馏水漂洗，然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1mol/LHCI中，在60℃恒温条件下解离10～15分钟，当根尖透明呈米黄色时取出，用蒸馏水冲洗2～3次。
酶解：
将根尖从固定液中取出，放在0.1mol/L醋酸钠中漂洗，用刀片切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把分生组织切成2～3片），把根尖分生组织放到醋酸钠配制的2％的纤维素酶和2%果胶酶的等量混合液中，在25～28℃条件下处理4～5小时。
此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上0.1mol/L醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再放入45％醋酸。
（8）后低渗：
将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗2～3次（约10分钟）。
酶解后的根尖放入蒸馏水中浸泡10～15分钟，然后再冲洗2～3次。
一定要冲洗干净，否则影响染色。
低渗后的根尖放入70%酒精后备用。
洗载片的洗涤如下：
①1mol/LHCl中30分钟以上
自来水（每片单独漂洗），接着用双蒸水洗
95%酒精浸泡30分钟以上
（9）染色体制片：
小心吸去酶液，水洗几次，吸取1～2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂开，火焰干燥。
在普通光学显微镜进行观察，通过镜检初步筛选一批染色体分裂像较多的制片，并用记号笔做好标记以便做荧光染色备用。
（10）荧光染料DAPI复染
配制一定浓度的荧光染料DAPI，在暗室里对紫景天染色体制片进行了荧光染色体。
（11）荧光显微镜镜检及拍摄
把复染的染色体制片利用荧光显微镜进行镜检，并且对染色体各时期分裂像都进行了一定量的拍照，并把拍摄好的照片在硬盘里备份保存。
（12）图像的处理及分析
我们把拍摄好的染色体照片进行分析，首先选取分散较好的前中期染色体进行统计，并利用Photoshop软件进行图片处理和核型分析，SPOTadvanced软件测量染色体长度，同时利用excel表对相关的数据进行分析统计，并构建其相应的核型模式图。
5.2龙葵染色体制片及观察
5.2.1龙葵的生根培养
⑴浸种：
分别取两种龙葵的适量的种子于烧杯中，室温下浸种一天。
⑵发芽：
培养皿中垫湿滤纸一层，种子分散其上，留一些间隔，不能堆积，25-30℃下发芽，每天水洗1-2次，约3-4天可取根尖。
（勤换水很重要，水不能过多，一般以不留流动水为宜，保证种子处在湿润的条件下，水分过多易长芽但根长不好，水太少则容易干死，得不到根尖。
）
5.2.2种子培养过程观察
除了勤换水，保证种子处在最佳培养条件下外，还应及时取根尖。
当根长至1-1.5cm时，切取1cm左右的根尖（早上10：
00-11：
00取根尖可以得到更好的分裂相），根尖太短，所得分裂细胞数目太少，不利于染色体观察，太长，不利于制片。
5.2.3根尖染色体制片
⑴预处理为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应对剪下的根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制和破坏纺锤丝的形成．促使染色体缩短和分散。
①低温预处理：
将剪取的根尖浸入盛有蒸馏水的烧杯内，置于4℃的冰箱中进行低温处理24小时。
此法效果很好。
对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀。
②药物预处理：
⑵根尖的低渗低渗是为了使染色体更好的分散。
在固定前用0.075mol/LKCl室温下处理30分钟，酶解后用蒸馏水低渗15-30分钟，使染色体分散效果更好。
⑶固定与水洗借助于物理方法或化学药物的作用，迅速渗入组织和细胞将之杀死，使其形态结构和内含物尽可能保持生活时的完整和真实状态。
固定时，将预处理过的根尖用蒸馏水冲洗两次（约5分钟）。
然后移入卡诺氏固定液中，在4-15℃条件下固定20-24小时后用70％酒精冲洗2次转入70％酒精中。
或将预处理过的根尖放入0.075mol/LKCI溶液中低渗20分钟，然后在蒸馏水中冲洗2-3次（约10分钟）待用。
⑷解离使分生组织细胞间的果胶质分解．细胞壁软化或部分分解．使细胞和染色体容易分散压平。
解离有酸解和酶解两种方法：
①酸解：
将根尖从固定液中取出，用蒸馏水漂洗．然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1mol/LHCI中，在60℃恒温条件下解离10-15分钟，当根尖透明呈米黄色时取出，用蒸馏水冲洗2-3次。
②酶解：
将根尖从固定液中取出，放在0.1mol/L醋酸钠中漂洗，用刀片切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把分生组织切成2-3片），把根尖分生组织放到醋酸钠配制的2％的纤维素酶和2%果胶酶的等量混合液中,在25-28℃条件下处理4-5小时。
此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉．再滴上0.1mol/L醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再放入45％醋酸。
⑸后低渗将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗2-3次（约10分钟）。
酶解后的根尖放入蒸馏水中浸泡10-15分钟，然后再冲洗2-3次。
⑹洗载玻片
①将载玻片置于1mol/LHCl中30min以上。
②用自来水（每片单独漂洗）漂洗，然后用蒸馏水漂洗。
③将漂洗后的载玻片置于95%酒精中浸泡30min以上。
5.2.4染色体制片
用火焰干燥法制片：
用光学显微镜初步镜检，筛选备用。
5.2.5龙葵染色体制片染色及观察
Giemsa染色
（1）准备染液用pH为6.8-7.0的Sorense缓冲液，按Giemsa染液：
Sorense缓冲液为1：
20或1：
40比例取Giemsa染液和Sorense缓冲液混合配成染色液。
染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。
缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。
（2）Giemsa染色经过2ⅹssc处理后的片子在Giemsa染液中60℃下染色2-3小时。
（3）洗片将经Giemsa染色后的片子用自来水洗去玻片上多余的燃料，自然干燥。
荧光染料DAPI复染
5.2.6镜检及拍照
晾干的片子在显微镜下镜检。
每种类型随机选取30个细胞进行染色体数目鉴定；
每种类型选取染色体分散好的、形态清晰的5个细胞通过PhotoShop软件和SPOT软件结合G-带带型完成染色体核型分析。
5.3水稻染色体制片
中期染色体制片参照Song和Gustafson（1995）的方法并略作修改。
切取生长旺盛的根尖（1~2mm），0.075MKCl前低渗处理30min，甲醇/冰醋酸（3:
1）固定，双蒸水充分清洗根尖，2%的果胶酶及纤维素酶1:
1混合28oC下酶解3~4h，双蒸水后低渗30min火焰干燥制片，-20oC贮存备用。
药用野生稻减数分裂染色体制片参照Kurata等（1981）程序稍加修改，在花粉母细胞处于减数分裂时期，以卡诺氏固定液固定幼穗后，从小穗中剥取花粉囊，用2%果胶酶（SERVA）和2%纤维素酶（SERVA）1:
1混合，在28oC下酶解1.5~2.5h左右，吸去酶液，轻轻水洗3次，火焰干燥法制片，亦可用滴片法制备粗线期染色体，即将酶解好的花粉囊，加双蒸水轻轻吹打，使其细胞完全散开，后低渗15min，3000~3600rpm离心5min，然后加固定液重新固定10~15min，换新鲜固定液，悬浮滴片，火焰干燥后-20oC保存备用。
5.4染色体原位杂交及信号检测
5.4.1原位杂交
参照Gustafson和Dille（1992）方法并略作修改。
1）染色体制片60℃烘片1h。
2）37℃于RNaseA（10µ
g/ml，用2×
SSC稀释）溶液中处理1h。
3）4％多聚甲醛（2×
SSC）室温下处理10min。
4）2×
SSC，室温下处理5min。
5）2×
SSC，室温下处理10min。
6）70%甲酰胺70℃处理3.5min。
7）于-20℃70%、95%、100%乙醇中各处理5min。
8）染色体制片在室温下充分干燥。
9）杂交液90℃变性10min后，迅速于冰上放置20min。
杂交液配方见表1。
表5FISH杂交液配方
探针
类型
去离子
甲酰胺
硫酸葡萄糖
探针量
鲑精DNA（ssDNA）
20×
SSC
SDS
50%
8%
100ng
2µ
g
10%
0.1%
10）加50μl杂交液至染色体制片上，盖24×
50mm的盖玻片，注意不要产生气泡，80℃共变性1.5~3min（变性时间根据不同染色体制片而定），染色体制片于37℃保湿皿中孵育24h。
2.3.7.2信号检测
对于中期、间期、粗线期染色体制片，杂交后的荧光检出程序包括以下步骤：
1）洗片：
20％甲酰胺，42℃洗10min；
2×
SSC，42℃10min；
0.2×
SSC，42℃10min；
1×
PBS室温洗10min。
2）凉干片子每张片子加50μl链亲和素-Cy3（streptavidin-Cy3）（0.4μl1mg/ml的链亲和素-Cy3用1%BSA/PBS稀释成50μl）或抗地高辛-FITC（anti-Digoxigenin-FluoresceinFabFragment）（3μl200μg/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀释成50μl），37℃于保湿皿中温育1h。
室温1×
PBS洗3次，每次5min。
3）凉干片子每张片子加50μl生物素链亲和素（BiotinylatedStreptavidin）（0.4μl1mg/ml的生物素链亲和素用1%BSA/PBS稀释成50μl）或兔抗羊-生物素偶联物（rabbitanti-goatbiotinconjugated）（3μl200μg/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀释成50μl），37℃于保湿皿中温育1h。
4）凉干片子每张片子加50μl链亲和素-Cy3（streptavidin-Cy3）（0.4μl1mg/mL的链亲和素-Cy3用1%BSA/PBS稀释成50μl），37℃于保湿皿中温育1h。
5）每张制片加40μl10μg/mLDAPI复染，OLYMPUSBX61显微镜观察，用CaseDataManagerExpo2.1.1图象系统控制的Cool-1300QSCCD（VDS，Germany）照相系统摄取图片，FISHViewEXPO2.0软件图片处理和核型分析。
6实验结果
相关的实验结果，见培训课件ppt。
作者简介：
蓝伟侦性别：
男民族：
畲族
出生年月日：
1980年12月13日，籍贯：
浙江武义
简历：
1999.09－2003.07本科中南民族大学生物技术专业
2003.09－2006.07硕士中南民族大学分析化学专业
2006.08－2009.07浙江湖州师范学院生科院
2009.08－至今武义县第三中学
简介：
项目负责人近年来先后参加了多项科研项目，包括国家高技术发展计划（863）（批准号：
2004AA227120），教育部留学回国人员启动基金（批准号：
BZY04003），中国博士后科学基金（批准号：
20040350574），武汉市青年科技晨光计划（批准号：
2004500607135）。
负责人以第一作者发表或待发表文章：
1.LanWZ,QinR,LiG,HeGC.ComparativeanalysisofA,B,CandDgenomesinthegenusOryzawithC0t-1DNAofCgenome.ChineseScienceBulletin,2006,51（14）:
1710-1720（SCI）
2.LanWZ,HeGC,WangCY,WuSJ,QinR.ComparativeAnalysisofGenomesinOryzasativa,O.officinalis,andO.meyerianawithC0t-1DNAandGenomicDNAofCultivatedRice.AgriculturalSciencesinChina2007,6（9）:
1027-1034（一级期刊）
3.ZhouJBLanWZQinR，ComparativekaryotypicanalysisofAandCgenomesinthegenusOryzawithC0t-1DNAandRFLP，Front.Agric.China2011,5
（2）:
173–180（通讯作者，武义三中）
4.蓝伟侦，覃瑞，李刚，何光存.利用C基因组C0t-1DNA对稻属A,B,C和D基因组的比较分析.科学通报，2006，51（12）：
1422-1431（SCI）
5.蓝伟侦，何光存，吴士筠，覃瑞.利用水稻C0t-1DNA和基因组DNA对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组的比较分析.中国农业科学，2006，39（6）：
1083-1090（一级期刊）
6.蓝伟侦，柳哲胜，李刚，覃瑞.Bph15在非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻中的BAC-FISH比较物理定位.作物学报，2007，33（4）:
560-565（一级期刊）
7.蓝伟侦，李刚，何光存，吴士筠，刘钊，覃瑞.一个药用野生稻异源单体附加系在减数分裂时期的GISH分析鉴定.中南民族大学学报，2006，25
（1）：
28-31
8.蓝伟侦，张海洋，徐秀芳.少花龙葵与黄果龙葵染色体核型分析.广西植物，2009，29（5）：
599—602（核心期刊）
此外，其中1篇荣获湖北省生物化学和分子生物学协会优秀学生论文，及获得校优秀硕士毕业论文。
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