海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究Word文档下载推荐.docx
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FucoidanextractedfromBrownAlga;
Antitumor
Fucoidan是一种从日本褐藻Undariapinnatifida中提取的天然多糖类成分,含有4-单邻磺酸-L-岩藻吡喃糖。
现有研究证明,从多种褐藻中提取的Fucoidan具有多种生物效应,如抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等,已在日本作为功能食品、化妆品等广泛使用[1]。
其抗肿瘤作用尤引起人们的关注。
本实验以体内、体外方法,观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用,并了解其对动物免疫功能的影响,以对其抗肿瘤机理进行探讨,为其临床应用提供基础。
1材料1药品与试剂
Fucoidan由武汉和利有限公司提供,为黄褐色粉末,在水溶液中溶解度好。
环磷酰胺:
山西普德药业有限公司生产。
Ⅳ型胶原酶、噻唑蓝、放线菌素D、脂多糖:
购自Sigma公司;
RPMI-1640培养基、新生牛血清:
GIBCO公司生产。
2动物及分组
昆明种小鼠,18~22g,雌雄各半。
体内抗肿瘤活性的检测实验将小鼠随机分为模型组,Fucoidan小、中、大剂量组及阳性对照组共5组,每组20只;
对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分为对照组,Fucoidan小、中、大剂量组共4组,每组10只。
Fucoidan小、中、大剂量组分别按1,2,3mg/10g灌胃给药,对照及模型组和阳性对照组同法给予等量生理盐水和mg/10g环磷酰胺,1次/d。
3瘤株
A549细胞、HeLa细胞、L1210细胞:
由武汉大学典藏中心提供;
荷瘤S180腹水型小鼠:
由华中科技大学同济医学院提供。
2方法
体内抗肿瘤活性的检测[2]
模型组和Fucoidan各组按剂量要求预防性灌胃给药7d。
第7天给药后1h,由荷瘤S180腹水型小鼠体内无菌抽取腹水,显微镜下计数,以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至×
1010/L,混匀后,每鼠右腋皮下注射肿瘤细胞悬液ml。
各组如前给药,连续2周,最后1次给药24h,动物处死,并剖取各组动物皮下肿瘤,称重。
与模型组比较,计算抑瘤率。
体外抗肿瘤活性的检测[2]
采用MTT法。
10%RPMI1640生长培养基培养细胞,收集对数期细胞,用2%RPMI1640维持培养基调节细胞浓度,除空白调零孔外,每孔均匀接种约2×
104个细胞/180μl到96孔板中。
空白调零孔仅加入10%RPMI1640180μl。
37℃、饱和蒸气、5%CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁,37℃、饱和蒸气、5%CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁,然后除空白调零孔及正常对照孔外,每孔分别加入终浓度为5×
10-1,1×
10-1,5×
10-2,1×
10-2,5×
10-3,1×
10-3,5×
10-4,1×
10-4mg/ml的Fucoidan20μl,每个浓度各设4个复孔,正常对照孔仅加入PBS20μl。
因Fucoidan有颜色,每个浓度组均设一不加细胞,只加20μl相应浓度培养液的对照孔。
Fucoidan继续培养48h后,弃去孔内液体,每孔加入5mg/mlMTT20μl,37℃、饱和蒸气、5%CO2培养箱放置4h。
每孔加入DMSO20μl,37℃、饱和蒸气、5%CO2培养箱放置30min后,平板离心机2000g×
10min离心后,低速振荡15min,使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的光密度值。
给药各组所测OD570需减去对照孔OD570。
对正常小鼠免疫功能的影响
碳粒廓清法[3]:
各组按分组灌胃给药7d,1次/d。
最后一次给药后1h,每只小鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁ml/kg,注毕即刻计时。
在注射墨汁后3min和13min,分别以预先用肝素处理过的玻璃毛细管刺入小鼠眼内眦取血ml,将所取血液加入含%Na2CO32ml的试管中,摇动试管使均匀混合,在分光光度计上测定600nm波长处每个样品的光密度值,%Na2CO3液作空白对照。
称重肝脾末次取血后,立即颈椎脱臼处死小鼠,取出肝脾,去除脂肪和结缔组织,滤纸拭干后分别称重记录。
并计算清除速度K值、吞噬指数α和脾、胸腺脏器指数:
清除速度K值K=LgOD1-LgOD2t2-t1
吞噬指数α:
α=体重肝重-脾重×
3K
脾、胸腺脏器指数=器官重量/体重×
10
2,4-二硝基氟苯诱导迟发性变态反应[2]:
各组按分组灌胃给药7d,1次/d。
第7日给药后,每鼠腹部剪毛,均匀涂抹1%DNFB50μl致敏,继续用药后第5天再用1%DNFB10μl攻击右耳,24h后处死动物,用打孔器取下直径8mm耳片,称重,以左右耳重量之差来表示DTH程度。
统计学处理
数据均以±
s表示,两组间均数比较采用t检验。
3结果
Fucoidan对S180实体瘤的抑制作用
肉眼观察,模型组小鼠瘤块不断增大,边界不清,不易剥离,而Fucoidan小、中、大各剂量组瘤块与周围组织界限较清楚。
表1所示,Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长,且呈现剂量相关性,其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的%~%,提示具有有效的抗肿瘤生长作用。
表1海藻提取物对小鼠S180实体瘤重量的影响
Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的影响
结果见表2。
Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的A570均无显着影响。
提示其并无直接杀伤肿瘤细胞的能力。
表2Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞OD570的影响
Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响
结果见表3。
Fucoidan中剂量组和大剂量组能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α和脾脏器指数,且呈现明显剂量相关性,但对胸腺脏器指数影响不大。
表3Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响
4讨论
大量药理及临床研究表明,海藻中的提取物具有有效的抗肿瘤作用[4],特别是多糖成分,能提高机体的免疫功能,用于癌症的辅助治疗中,具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点[5]。
本实验结果显示,海藻提取物Fucoidan能抑制小鼠移植性S180实体瘤的生长,具有确切的体内抗肿瘤作用。
而就其机制而言,活性多糖一般是作为生物免疫反应调节剂,通过增强机体的免疫功能,尤其是非特异性免疫功能,而间接抑制或杀死肿瘤细胞的[6]。
碳粒廓清实验是反映非特异性免疫功能的经典实验,能表现单核巨噬细胞系统的吞噬能力,活化的单核巨噬细胞对肿瘤细胞可产生直接的杀伤和抑制作用,在机体对抗肿瘤的环节中起重要作用。
而DNFB诱导迟发性变态反应是机体细胞免疫功能的另一敏感指标,反映T淋巴细胞功能。
Fucoidan能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数α、脾脏器指数和DNFB诱导迟发性变态反应。
但Fucoidan对体外培养肿瘤细胞的生长并未显示确切的直接抑制作用,这种对细胞无毒的特点,明显不同于常用细胞毒类抗癌药。
提示Fucoidan可能是通过增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用。
【参考文献】
[1]TakeshiTeruya,TerukoKonishi,ShuntokuUechi,etal.Anti-proliferativeactivityofoversulfatedfucoidanfromcommerciallyculturedCladosiphonokamuranusTOKIDAinU937cells[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2007,40(3):
221.
[2]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学,第3版[M].北京:
人民卫生出版社,2002:
1785,1420.
[3]陈奇.中药药理实验方法学,第1版[M].北京:
人民卫生出版社,1993:
317.
[4]杨文豪,吕俊华,徐石海.海藻提取物A1和A2抑制肝癌和肺腺癌细胞增殖作用的实验研究[J].辽宁中医杂志,2005,32:
371.
[5]刘海洲,刘均红.海藻多糖的生物活性及医药应用研究新进展[J].化工科技市场,2005,8:
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[6]李玉芳,王杰.中药多糖抗肿瘤机制研究进展[J].实用癌症杂志,2007,22:
546.