海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究Word文档下载推荐.docx

1、Fucoidan extracted from Brown Alga ; Antitumor Fucoidan是一种从日本褐藻Undaria pinnatifida中提取的天然多糖类成分，含有4-单邻磺酸-L-岩藻吡喃糖。现有研究证明，从多种褐藻中提取的Fucoidan具有多种生物效应，如抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等，已在日本作为功能食品、化妆品等广泛使用1。其抗肿瘤作用尤引起人们的关注。本实验以体内、体外方法，观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响，以对其抗肿瘤机理进行探讨，为其临床应用提供基础。 1 材料1 药品与试剂Fucoida

2、n由武汉和利有限公司提供，为黄褐色粉末，在水溶液中溶解度好。环磷酰胺：山西普德药业有限公司生产。型胶原酶、噻唑蓝、放线菌素D、脂多糖：购自Sigma公司；RPMI-1640培养基、新生牛血清：GIBCO公司生产。2动物及分组昆明种小鼠，1822 g，雌雄各半。体内抗肿瘤活性的检测实验将小鼠随机分为模型组，Fucoidan小、中、大剂量组及阳性对照组共5组，每组20只；对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分为对照组，Fucoidan小、中、大剂量组共4组，每组10只。Fucoidan小、中、大剂量组分别按1，2 ，3 mg/10 g灌胃给药，对照及模型组和阳性对照组同法给予等量生理盐水和 mg/10

3、g环磷酰胺，1次/d。3 瘤株A549细胞、HeLa细胞、L1210细胞：由武汉大学典藏中心提供；荷瘤S180腹水型小鼠：由华中科技大学同济医学院提供。2 方法体内抗肿瘤活性的检测2模型组和Fucoidan各组按剂量要求预防性灌胃给药7 d。第7天给药后1 h，由荷瘤S180腹水型小鼠体内无菌抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至1010/L，混匀后，每鼠右腋皮下注射肿瘤细胞悬液 ml。各组如前给药，连续2周，最后1次给药24 h，动物处死，并剖取各组动物皮下肿瘤，称重。与模型组比较，计算抑瘤率。体外抗肿瘤活性的检测2采用MTT法。10RPMI 1640生长培养基培养细胞，收集

4、对数期细胞，用2RPMI 1640维持培养基调节细胞浓度，除空白调零孔外， 每孔均匀接种约2104个细胞180 l到96孔板中。空白调零孔仅加入10RPMI 1640 180 l。37、饱和蒸气、5CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，37、饱和蒸气、5CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，然后除空白调零孔及正常对照孔外，每孔分别加入终浓度为510-1， 110-1， 510-2 ， 110-2，510-3，110-3，510-4，110-4mg/ml的Fucoidan20 l，每个浓度各设4个复孔，正常对照孔仅加入PBS 20 l。因Fucoidan有颜色，每个浓度组均设一不加细胞，只加20 l 相

5、应浓度培养液的对照孔。Fucoidan继续培养48 h后， 弃去孔内液体，每孔加入5 mg/ml MTT 20 l, 37、饱和蒸气、5CO2培养箱放置4 h。每孔加入DMSO 20 l,37、饱和蒸气、5CO2培养箱放置30 min后，平板离心机2 000 g10 min离心后，低速振荡15 min, 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的光密度值。给药各组所测OD570需减去对照孔OD570。对正常小鼠免疫功能的影响 碳粒廓清法3：各组按分组灌胃给药7 d, 1次/d。最后一次给药后1 h，每只小鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁 ml/kg，注毕即刻计时。在注射墨汁后3 m

6、in和13 min，分别以预先用肝素处理过的玻璃毛细管刺入小鼠眼内眦取血 ml，将所取血液加入含Na2CO3 2 ml的试管中，摇动试管使均匀混合，在分光光度计上测定600 nm波长处每个样品的光密度值, Na2CO3液作空白对照。称重肝脾 末次取血后，立即颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脾，去除脂肪和结缔组织，滤纸拭干后分别称重记录。并计算清除速度K值、吞噬指数和脾、胸腺脏器指数：清除速度K值K=LgOD1-LgOD2t2-t1 吞噬指数：=体重肝重-脾重3K 脾、胸腺脏器指数器官重量/体重10 2，4-二硝基氟苯诱导迟发性变态反应2：各组按分组灌胃给药7 d，1次/d。第7日给药后，每鼠腹部剪毛，

7、均匀涂抹1% DNFB 50 l致敏，继续用药后第5天再用1% DNFB10 l攻击右耳，24 h后处死动物，用打孔器取下直径8 mm耳片，称重，以左右耳重量之差来表示DTH程度。统计学处理数据均以s表示，两组间均数比较采用t检验。3 结果Fucoidan对S180实体瘤的抑制作用肉眼观察，模型组小鼠瘤块不断增大，边界不清，不易剥离，而Fucoidan小、中、大各剂量组瘤块与周围组织界限较清楚。表1所示，Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰胺阳性对照的%，提示具有有效的抗肿瘤生长作用。表1 海藻提取物对小鼠S180实体瘤重量的影响Fucoid

8、an对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的影响结果见表2。Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的A570均无显着影响。提示其并无直接杀伤肿瘤细胞的能力。表2 Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞OD570的影响Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响结果见表3。Fucoidan中剂量组和大剂量组能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数和脾脏器指数，且呈现明显剂量相关性，但对胸腺脏器指数影响不大。表3 Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响4 讨论 大量药理及临床研究表明，海藻中的提取物具有有效的抗肿瘤作用4

9、，特别是多糖成分，能提高机体的免疫功能，用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点5。本实验结果显示，海藻提取物Fucoidan能抑制小鼠移植性S180实体瘤的生长，具有确切的体内抗肿瘤作用。而就其机制而言，活性多糖一般是作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能，尤其是非特异性免疫功能，而间接抑制或杀死肿瘤细胞的6。碳粒廓清实验是反映非特异性免疫功能的经典实验，能表现单核巨噬细胞系统的吞噬能力，活化的单核巨噬细胞对肿瘤细胞可产生直接的杀伤和抑制作用，在机体对抗肿瘤的环节中起重要作用。而DNFB诱导迟发性变态反应是机体细胞免疫功能的另一敏感指标，反映T淋巴细胞功能。F

10、ucoidan能显着提高碳粒廓清实验中的廓清指数K、吞噬指数、脾脏器指数和DNFB诱导迟发性变态反应。但Fucoidan对体外培养肿瘤细胞的生长并未显示确切的直接抑制作用，这种对细胞无毒的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药。提示Fucoidan可能是通过增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用。【参考文献】 1Takeshi Teruya, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi, et al. Anti-proliferative activity of oversulfated fucoidan from commercially cultured Cladosiphon oka

11、muranus TOKIDA in U937 cellsJ. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 40（3）: 221. 2徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学，第3版M.北京：人民卫生出版社，2002：1785，1420.3陈奇.中药药理实验方法学，第1版M. 北京：人民卫生出版社，1993：317.4杨文豪，吕俊华，徐石海.海藻提取物A1和A2抑制肝癌和肺腺癌细胞增殖作用的实验研究J.辽宁中医杂志，2005，32：371.5刘海洲，刘均红.海藻多糖的生物活性及医药应用研究新进展J.化工科技市场，2005，8：29.6李玉芳，王杰.中药多糖抗肿瘤机制研究进展J.实用癌症杂志，2007，22：546.