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第二章pH对猪精液常温保存效果研究9

2.1.材料与方法10

2.1.1试验动物和采精时间10

2.1.2采精方法10

2.1.3试验仪器10

2.1.4精液处理10

2.1.5精液品质检查方法10

2.1.6稀释剂配方11

2.1.7精液保存12

2.1.8数据处理12

2.2结果与分析12

2.2.1不同保存时间精子活率的变化12

2.2.2不同保存时间精液pH的变化13

2.3讨论13

2.3.1稀释粉对猪精子活力的影响13

2.3.2稀释粉对猪精液保存过程中pH的影响14

2.3.3稀释精液pH对精子活率的影响14

2.4结论14

参考文献15

致谢17

作者：

朱园园指导老师：

胡建宏教授

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

摘要：

猪精液常温保存技术随着人工授精技术的广泛应用日益显现出其重要性。

在常温保存过程中pH对于猪精液的质量影响比较大。

本试验选取自配稀释粉Modena和BTS，通过对比2种稀释液保存后精子的活力、有效保存时间、pH，证明当稀释精液pH处于7.0～7.3之间的稳定状态时，精子活率高于0.6，此时稀释精液可以用于人工授精。

当稀释精液pH呈酸性时，精子活率迅速下降到0.6以下显著低于pH稳定状态（p<

0.05）。

当稀释精液pH大于7.3时精子活率逐渐下降，在之后2d时间内精子活率显著低于pH稳定状态（p<

关键字：

猪人工授精；

常温保存；

pH；

精子活力

AnalysisofdifferentpHeffectsonporcinesemenstoredatroomtemperature

Abstract:

Pigsemenstoredatroomtemperaturetechnologyaswidelyusedartificialinseminationtechnologyisincreasinglyshowingitsimportance.pHduringstorageatroomtemperatureforboarsemenqualityimpactisrelativelylarge.WhenthistestwithdilutedpowderselectedfromModenaandBTS,bycomparingthetwokindsofdynamicdilutionpreservationofsperm,effectivelysavingtime,pH,provedthatwhensemenpH7.0to7.3inasteadystatebetweentherateofspermmotility0.6,thendilutedsemencanbeusedforartificialinsemination.WhenthepHisacidicsemen,spermmotilitydecreasedrapidlytopH0.6wassignificantlylowerthanthesteadystate（p<

0.05）.WhenthepHisgreaterthan7.3semenspermmotilitydecreasedgraduallyafter2dtimeinspermmotilitywassignificantlylowerthanthepHsteadystate（p<

0.05）.

Keywords:

SwineArtificialInsemination:

storageatroomtemperature:

pH:

spermmotility

文献综述

第一章猪精液常温保存研究进展

　　随着我国经济的飞速发展，人们的生活水平日益提高，使得人们对于物质的需求也越来越高，特别是在饮食方面对于肉类的需求和质量有了更高的要求。

而在我国的肉类消费中猪肉占到70%的比例[1]，为了适应市场的需求，养猪业一方面要扩大规模，另一方面要加速猪种的改良和猪的繁殖性能。

在这种情况向，猪人工授精技术得到进一步的发展与应用。

与传统的自由交配相比较，人工授精可以提高优良公猪的利用率，减少公猪的饲养头数，克服本交时体格悬殊的障碍，避免疫病的传播，特别是在规模化集约化养猪场，采用人工授精是提高经济效益的一项重要措施。

　　随着人工授精技术的发展与应用，人们开始对猪精液保存技术进行深入的研究。

随着精液保存技术的发展，猪人工授精技术将会得到更广泛的应用。

现在的猪精液保存方法基本上可以分为常温保存（15～25℃），低温保存（0～5℃）和冷冻保存（-79～-196℃）三类[2]。

目前应用猪冷冻精液进行人工授精后，母猪的受胎率低，且冷冻操作程序复杂，实际生产中存在很多问题，而低温保存技术也不甚成熟。

因此，猪的人工授精主要采用常温保存的精液，而稀释液是影响常温保存精液效果的关键因素。

猪精液常温保存稀释剂配制的稀释液可以为精子提供代谢所需的能量物质、适当的pH和渗透压环境，以保证精子在体外具有较强的抗逆性及结构功能的完整性，延长猪精子存活时间、保持其受精能力。

1.1猪精液常温保存研究进展

精液常温保存的定义与冷冻精液和低温精液相对应，国家颁布实施的《猪常温精液生产与保存技术》标准中对猪常温精液做出了明确规定，建立了以保存温度命名精液产品的规则，明确了猪精液稀释剂产品的分类标准。

常温精液是指猪原精液经稀释处理后在16～18℃下短期保存，并具有受精能力的精液。

1.1.1常温保存的方法

　　采集并检查合格的原精液在温室下进行稀释。

精液采集后应尽快稀释，原精贮存不能超过30min[3]。

稀释操作时要求精液与稀释液的温度不能超过1℃，并且只能通过调节稀释液的温度使精液与稀释液的温度尽可能的接近。

稀释时，将适量的稀释液缓慢的加入到精液中，然后轻轻摇动或用消毒的玻璃棒搅拌，使两者轻柔混匀。

稀释后的精液需要缓慢降温到16～18℃，然后在此温度下保存。

精液应在排出空气的密闭容器中避光保存，减少与氧气接触，抑制精子的代谢，延长精液的保存时间。

以上操作均为防止环境变化过于突然导致精子休克死亡或活力下降。

1.1.2猪精液常温保存的意义

我国的养猪业正在从传统的散户型向集约化、规模化、专业化方向发展。

养猪业是关系到我国人民的生活水平，影响我国经济发展的全局，发展好养猪产业，对于促进我国经济发展、维护社会和谐稳定具有重要的意义。

而人工授精技术的应用使养猪生产者降低成本，提高效益，加速品种改良的进程，克服地域限制，在很大的范围内实现资源共享，并且在一定程度上避免了疫病发生[4]。

而猪精液稀释保存是提高人工授精技术的首要环节，所以猪精液常温保存对于推动猪人工授精技术的发展具有重大意义。

1.2影响猪精液常温保存的因素

目前在猪人工授精技术应用中，精液的常温保存技术是影响受精效果的关键因素。

在我国猪的人工授精技术经过数年的推广，已得到了广泛的使用，普及率达到85%以上。

随着该项技术的广泛应用，家畜精液的保存技术也发展起来，并在繁殖控制和现代畜牧业生产中日益显出重要作用。

精液保存技术是通过降低或抑制精子的新陈代谢强度从而达到延长精子在体外存活时间的一项技术。

猪精液的保存不像牛精液保存技术那么成熟，猪精子的生理特点决定了猪精液对低温耐受性不强，对15℃以下温度敏感。

因此经过大量的实践证明，常温保存更有利于猪精液的保存，且保存条件要求低，操作简单，输精后受胎率高，更适合在养殖场和基层改良站开展生产。

国际上对猪精液液态常温保存也十分重视，多年来，各国研究者对影响精液保存效果的诸多因素进行了广泛而深入的研究，已经基本能确定影响猪精液常温保存效果的因素包括：

温度、pH、缓冲体系、抗菌素、渗透压、精子膜结构和延长精液贮存时间的添加物等[5]。

常温精液保存时，一方面可以通过控制环境温度、稀释液的pH和渗透压来抑制精子的活动，使精子处于可逆的静止状态来延长精液的保存时间；

另一方面，通过向稀释液中添加抗菌素来抑制精液中细菌的活动和繁殖，降低有害细菌对精子的伤害。

1.2.1保存温度对猪精液保存效果的影响

　　哺乳动物精液在较低温度保存时可有效降低精子能耗和有害代谢物生成，抑制精液内细菌的活动，延长精液的保存时间，提高精液的保存效果。

但是猪精子对低温很敏感，当猪精液保存温度低于15℃时，可能导致猪精子发生冷休克，造成精子活力下降和顶体完整性受损。

这可能与猪精子质膜中包含高浓度不饱和脂肪酸有关。

此过程中，精子细胞膜中不同脂类在不同温度发生由液相到胶相的相变、分离，使膜流动性下降，蛋白质运动和组装受阻，选择通透性丧失，胞内离子和酶外流，膜上酶活性下降，膜通道调节失控。

猪精子质膜磷脂酰胆碱含量较低，磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂含量较高，胆固醇分布不对称，在质膜外侧较多，而且胆固醇与磷脂比率显著低于其它哺乳动物精子[6]，这些因素使猪精子对低温特别敏感。

稀释前的猪精液在室温下放置数小时，精子则能对冷休克产生一定程度的耐受，对于延长保存时间、保证精子活率和顶体完整是必要的,其机理尚不清楚[7]。

经长期研究，人们逐渐确立15～20℃为常温保存的适宜温度。

5℃和25℃条件下保存的精液活力和顶体完整率下降速度均比15℃条件下要快。

猪新鲜精液在15℃和20℃保存48h后其顶体完整率和存活率比4℃和39℃结果好。

鲜红[8]等在稀释液配方筛选试验中发现，猪常温精液的适宜保存温度为14～18℃，温度低于14℃或超过20℃则会降低精液的存活时间。

康文彪[9]等在筛选稀释液配方的试验中发现，15～18℃条件下保存精液的效果最好。

因此，15～18℃在现阶段被认为是比较理想的保存温度。

1.2.2pH对猪精液保存效果的影响

　　猪精液常温保存是利用一定范围的酸性环境抑制精子活动，在弱酸性条件下精子代谢和活动力均减弱，从而延长猪精子在体外的存活时间。

精子在一定的pH区域内其活性被可逆性抑制，一旦恢复到pH7.0左右仍然可以恢复活性，但如果超出一定的酸性范围，会造成精子死亡[10]。

为了确定猪常温保存稀释液保存精液的最佳pH，在不同pH条件下保存精液的结果显示出在其他条件相同时，pH为6.5～6.9时的保存效果明显好于pH为6.0～6.4为的保存效果。

为了检验保存效果进行精子顶体染色的结果也显示，在常温保存条件下，稀释猪精液原液后控制pH为6.5～6.9，保存3d后精子的顶体完整率超过96%，并且保存的精子具有较高的受精能力[20]。

1.2.3抗菌素对猪精液保存效果的影响

　　猪的精液富含多种营养物质，葡糖糖、牛血清蛋白（BSA）、各种微量元素都是微生物繁殖代谢的重要C源、N源和能量物质，稀释液中的这些物质极利于微生物的生长繁殖。

而且在常温保存条件下，微生物繁殖速度几乎不受影响。

为了有效抑制微生物对精子的杀伤作用，在精液稀释液中加入抗微生物药物，是抑制微生物的繁殖，延长精液保存时间，提高受胎率，从而在实际生产中推动猪人工授精技术的普及的有效措施。

480IU/mL的庆大霉素和400IU/mL的恩诺沙星对精液的保存效果较好，高于或低于这个浓度都不利于精子的保存。

浓度过高，可能增加对精子本身的毒害作用，而浓度过低则达不到抑菌效果。

宋先忱等[11]的研究显示，猪精液常温保存时，当使用不同抗菌药物时，精液的保存效果不一致，其中庆大霉素与恩诺沙星保存效果最好。

由于在猪精液的采集和处理过程中，不可避免地会发生不同程度的微生物污染。

若精液被细菌污染，其保存效果则因细菌的种类和数量不同而异，并且指出大肠杆菌等对精液保存影响极大，可在短时间内使精子活力、顶体完整率、pH大幅度下降[12]。

通常情况下，人们采用青霉素作为精液稀释液的抗菌添加物，虽然青霉素对革兰氏阳性菌的抗菌效果较好，但对大肠杆菌等革兰氏阴性菌却没有良好的抑菌作用。

而大量试验证明庆大霉素与恩诺沙星对精液的保存效果优于青霉素等，具有药效稳定、迅速灭菌、无毒等优点，能直接作用于病原体的细胞核，阻断DNA复制的旋转酶，破坏细胞核酸合成，迅速杀灭病原体，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌、霉形体、支原体等均有强大的杀灭作用。

1.3猪精液品质评定指标

1.3.1精子活率

　　精子的活率和运动能力是与精子结构和功能的完整性紧密相关的，并且可以对精子潜在的受精能力作出推测。

精子的运动功能是在精子细胞形成精子的过程建立。

精子运动能力的健全是在附睾中进行的，但没有形态结构上的任何变化。

附睾头精子表现震动不等或杂乱无序的摆动。

附睾中段摆动幅度和灵活性较低，但少量精子可以快速向前运动。

到附睾尾大部分精子都能呈螺旋式向前运动。

当精子排出体外，精液逐渐液化，在30-60min内，精子的活动迅速增加[13]。

精液中群体精子有三种变化趋势：

活动上升趋势；

活动平缓下降；

活动能力迅速消失。

为此，这种变化趋势的差异，就成为精液进行实践存活率分析的依据。

精子的运动产生于尾部的鞭毛，而为精子提供ATP的部位主要是在颈部中段的线粒体鞘。

精子内ATP的浓度就决定了精子尾拍击的频率。

外周致密纤维对鞭毛向前运动器辅助和调节作用。

所以说，精子运动必须获能，而中部螺旋状的线粒体，是提供精子尾部运动的必要能量来源，如果说中部线粒体缺失或受损，将使精子运动迟缓或失去运动能力。

为此，在不活动的精子就要考虑其精子的线粒体受损和能量的来源问题。

精子运动功能的健全是在附睾内进行的，而这一成熟过程中没有发现任何精子的形态结构的变化。

而精子的运动是精子许多功能的一种综合和直观的表现。

虽然目前已经认识到精子的运动能力并不直接反映其受精的能力，如无头精子反而运动速度快。

所以，正常精子受精能力的丢失可能早于运动能力的丢失；

缺陷精子和不具备受精能力的精子，也可表现为正常的运动。

但不管怎样，正常的精子运动是在生理状态下，是完成授精过程的基础。

正常的授精过程需要有正常的或好的精子功能和正常的精子结构，而精子许多不同的功能状况以及结构的变化，可以通过精子运动的不同改变而加以体现。

这是我们认识精子运动功能的基础和关键。

精子的运动包括两方面内容：

精子运动的活力和运动的方式。

精子运动动力学认为：

精子的运动活力主要反映在精子头颈中段部，因为颈中段有丰富的线粒体，作为能量来源；

而精子运动方式，则主要表现在精子鞭毛的摆动形式，及因此产生的精子直线或非直线运动，其独立的运动功能，依赖于正常的鞭毛结构与ATP的存在。

对精子运动的检测和分析，其资料的精确性、丰富性和综合性，一方面取决于观察和研究的重点和需要，而更重要的一方面是取决于观察分析技术的质量和准确。

1.3.2精子顶体完整率

　　顶体在精子受精过程中起着重要的作用。

因为它能够释放蛋白质分解酶消化卵丘细胞之间的黏合基质，使精子能过通过卵的被膜进行受精。

由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或者不受精。

精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏，先是顶体脊部变化。

最后整个顶体消失，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间相关性更强。

因此，检查精子顶体完整率很重要。

　　精子穿过卵子透明带以前要发生顶体反应，掌握发生顶体反应时顶体结构变化，有助于我们进一步了解受精过程，从而找到提高受胎率的方法。

但精子只有具备完整的顶体才能发生顶体反应，从而穿过透明带[14]。

　　顶体反应是精子获能后的必然结果，一般包括包裹精子头部的质膜、顶体外膜融合和破裂，释放内含物的过程。

这一反应是精子与卵子融合必然经历的反应之一。

精子获能的一般过程为：

精子头部的质膜从赤道段的前部变得疏松，随后是质膜和顶体外膜发生融合，并形成许多泡状结构，最后由顶体膜和顶体基质释放出顶体酶系，主要是透明质酸酶和顶体素。

根据精子顶体完整和损伤与否，可以将顶体形态分为4种类型：

　　1.顶体完整型：

精子头部外形正常，着色均匀，顶体完整，边缘整齐，可见微隆起的顶体嵴，赤道带清晰。

　　2.顶体膨胀型：

顶体轻微膨胀，边缘不整齐，顶体嵴肿胀，核前细胞不明显或缺失。

　　3.顶体破损型：

顶体破损，精子质膜严重膨胀破损，着色钱且不均匀，头前部边缘不整齐。

　　4.顶体全脱型：

精子顶体全部脱落，精子核裸露。

1.3.3精子质膜完整率

　　精子能够成功与卵子受精需要具备功能良好的质膜，精子质膜上含有丰富的多聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分，精子的新陈代谢、活力的维持、获能、顶体反应以及精卵结合等都需要与精子质膜功能完整性密切相关[15]。

因此，精子质膜功能可能是评估精液质量的重要指标，其检测技术的研究已受到越来越来多的重视。

精子质膜组分对精子质量具有非常重要的作用，质膜功能良好更是精子发挥一些特定功能的必要前提。

作为一种半渗透屏障，精子质膜维持和调节胞内成分，质膜破损会导致精子内环境失衡，最终精子死亡。

现在发展了一下检测精子质膜功能的方法。

1.3.3.1精子尾部低渗肿胀试验

精子在低渗溶液中，必须重新建立内外液之间的平衡，水分子通过质膜进入精子，使精子体积增大而膨胀，这是活精子质膜功能正常的标志。

由于质膜的肿胀是精子尾部发生弯曲，这种变化在显微镜下很容易观察到，而质膜功能不全的精子表现为不膨胀。

所以发生肿胀的精子数越多，证明精子质膜无损伤，精子功能良好[16]。

这个试验简单、迅速，可作为体外精子质膜功能良好的指标，预测精子潜在的受精能力。

1.3.3.2伊红Y水试验

显微镜直接观测法容易将缺乏活力的精子认为是死精子，伊红Y水试验利用伊红Y水染料能使死精子着色的原理来提高区分精子存活率的准确性。

死亡的精子因质膜通透性改变可以使伊红Y染料透过精子质膜，精子质膜内带阳离子的物质可与带阴离子的酸性伊红Y染料结合被染成红色[17]。

显微镜下观察活精子不着色，胞质透明，死精子着红色。

伊红Y水试验除可检测精子尾部肿胀率来反映质膜功能外，还可以通过检测精子头部未着色率来评估精子头部质膜功能。

试验研究

第二章pH对猪精液常温保存效果研究

猪人工授精的成败在很大程度上取决于精液的质量。

由于猪精子对低温比较敏感，冷冻保存精液的效果较差，因此在猪人工授精中主要使用常温保存精液。

而常温保存稀释液的pH对于猪精液的影响比较大。

为了提高人工授精的效果和普及人工授精技术，对于猪精液的常温保存提出了更高的要求。

所以通过研究pH对于精液活率的影响和精子的生理活动来提高精液的常温保存技术，从而提高猪人工授精的效果。

本试验选取自配稀释液Modena和BTS，通过对比2种稀释液保存后精子的活力、有效保存时间、质膜完整率和顶体完整率，来分析精子在保存时间的生理活动以及用自配的不同的pH（5.75，6.00，6.25，6.50，6.75，7.00，7.25）稀释液进行常温保存，对精子的活力、畸形率，精子的有效存活时间，总存活时间进行分析。

2.1.材料与方法

2.1.1试验动物和采精时间

杨凌区养猪服务站，按常规饲养方法饲养管理，20月龄健康杜洛克、大约克和长白种公猪各6头。

2.1.2采精方法

手握法采精。

采精员首先洗净、消毒、擦干手掌，然后将手握成空拳，于公猪阴茎伸出同时，导入空拳拳内，让其抽送转动片刻，再用手紧握阴茎龟头螺旋部分，随阴茎充分勃起时顺势牵伸向前，不让滑脱，有节奏的一紧一松的施加弹性刺激，直至引起公猪射精。

公猪射精时，另一只手持带有过滤纱布的保温集精杯收集富含精子部分的精液，公猪射精停止，可按上述方法再次施加压力，即可引起公猪再次射精，直到公猪射精结束，自动从台畜上下来为止。

试验期间控制采精频率，隔天进行一次。

2.1.3试验仪器

超纯水仪、电子分析天平、恒温加热板、显微镜、水浴锅、恒温箱、保温箱等。

2.1.4精液处理

采得的猪精液用四层脱脂纱布过滤，除去胶状物，同时检查原精的品质。

2.1.5精液品质检查方法

2.1.5.1精子活率

按直线运动的精子数占视野中精子总数的百分率，具体操作步骤：

（1）从保温箱中取出精液，缓慢摇匀，保证离心管中精液均匀没有沉淀。

（2）在显微镜上放置恒温板，保持37~38℃。

（3）在显微镜下观察10个不同视野，在每个视野中分别记录20个精子的运动状况，记录呈直线运动精子的数。

（4）计算直线前进运动精子的百分率，即精子活率：

精子活率=直线运动的精子数/总精子数×

100%

2.1.5.2精子存活时间

从精液稀释完成开始计算，到稀释精液活率下降到0.6的时间。

2.1.5.3精子顶体完整率

对精子进行顶体染色，在显微镜下观察顶体完整精子的比例。

具体操作步骤：

（1）制片：

将精液滴于载玻片一端，用另一个载玻片推片，要求薄而均匀，风干5min。

（2）固定：

用滴管吸固定液，使载玻片一端稍抬高，将固定液缓缓向下流，直到铺满整个载玻片，然后平放静止15min后，将固定液弃去，用流水冲洗后，凉干。

（3）染色及观察：

用姬姆萨液染色90min后将染色液弃去，流水冲洗后待自然干燥，干后制成标本。

完全干燥后直接用400倍显微镜观察，精子顶体呈紫色包围精子头前部，检查五个不同视野，观察200个精子中顶体异常数，计算出精子顶体完整率。

（4）计算：

顶体异常率=顶体异常精子数/所计精子数×

100%

顶体完整率=1-顶体异常率

2.1.5.4精子质膜完整率

精子尾部低渗肿胀试验（hypo—osmoticswellingtest，HOST），在显微镜下观察肿胀弯尾的精子比例。

（1）配制低渗溶液：

取用果糖1.351g，二水柠檬酸钠0.735g，加双蒸水定容至1L，4℃保存备用。

（2）检测：

取用稀释液稀释后的精液0.1mL加入1mL低渗液，37℃恒温水浴30min，取一滴混合液于载玻片上，在400倍显微镜下观察200个精子，计算精子尾部出现膨胀的精子数占总精子数的比例。

（1）质膜完整率的计算：

质膜完整率=弯尾精子数/全部精子数×

2.1.6稀释剂配方

Modena与BTS的基础配方如下表1。

表1猪精液常温保存稀释液配方

Table1Compositionofdifferentextendersusedforliquidstorageofboarsemen

配方

Component

稀释液成分（g/ml）

Extendercomposition

无水葡萄糖

Anhydrous

glucose

柠檬酸三钠

Trisodiumcitrate

EDTA·

2Na

碳酸氢钠

Sodiumbicarbonate

氯化钾

Potassimchloride

柠檬酸

Citricacid

Tris

Modena

27.5

6.90

2.35

1.00