达托霉素的HPLC的方法学研究文档格式.docx

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P1301，94.7%

本实验室内部标定

水解物

P1301，91.4%

β-异构体

P1301，71.9%

脱水物

P1301，86.6%

达托霉素样品

S130301

浙江海正药业股份有限公司生产

二、方法建立与方法描述

（一）、方法建立

袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS（250×

4.6mm,5.0μm）;

梯度洗脱的流动相A:

乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液（30:

70）,流动相B:

乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液（70:

30）;

流速1.0mL/min;

检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。

由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器（DAD）检测，在190nm～360nm区间进行DAD全波段扫描。

通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。

由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用PhenomenexIB-SILC84.6×

m色谱柱。

（二）、方法描述

[含量]

色谱柱：

流速：

1.0ml/min

检测波长：

223nm

进样量：

柱温：

25℃

进样器温度：

2~8℃

流动相A：

称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1

流动相B：

流动相：

梯度洗脱

A（%）

B（%）

67.5

32.5

稀释剂：

标准溶液：

精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

样品溶液：

精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

系统适应性：

连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。

用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量：

湿计含量%=

Cs×

100%

式中：

Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml）

rs是标准溶液所对应的主峰峰面积

ru为样品溶液所对应的主峰峰面积

P为对照品的含量，%

无水无残溶含量计算公式：

干计含量%=

湿计含量%

1-水分%-残溶%

限度：

以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应≥93.0%。

[有关物质]

色谱条件和样品溶液同含量。

1%对照溶液：

精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量：

含量%=

Cu，Cs分别是样品溶液与1.0%对照溶液的配制浓度（mg/ml）

rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值

ru为样品溶液中各杂质对应的峰响应值

脱水达托霉素≤1.5%，β异构体杂质≤0.7%，水解物≤0.4%，杂质1（RRT约为0.79）≤0.2%，杂质2（RRT约为0.92）≤0.2%，杂质3（RRT约为0.94）（C9）≤0.6%，杂质4（RRT约为0.96）≤0.5%，杂质5（RRT约为1.07）（C11）≤0.7%，杂质6组（RRT约为1.20～1.25）≤0.6%

单个未知杂质≤0.1%，总杂质≤5.0%

三、验证内容

（一）、系统适应性

系统适应性溶液：

精密称取达托霉素对照品P130125.01mg和25.11mg，分别置于2个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，作为STD1溶液和STD2溶液。

当色谱系统平衡后，分别进1针空白溶液、进样5针STD1溶液和2针STD2溶液，计算RSD%和回收率，结果见表1。

表1.系统适应性结果

STD1的RSD:

≤2.0%

STD2回收率：

98.0～102.0%

序号

STD1峰面积

STD2峰面积

1st

22610.2

22805.0

2nd

22600.9

22695.4

3rd

22595.2

4th

22593.9

5th

22555.1

平均值

22591.1

22750.2

RSD（%）

0.09

0.34

回收率（%）

100.30

结论：

STD1的RSD%为0.09%，STD2的RSD%为0.34%，回收率为100.30%，均满足认可标准，系统适应性良好。

（二）、降解实验

通过对样品溶液及各种强降解条件下的产物使用DAD检测器进行分析，判断方法的专属性及稳定性指示性。

表2降解试验结果

溶液名称

新增杂质相对保留时间（RRT）

酸解

0.2424、0.2513、0.3534、0.4689、0.6032、0.6936、0.7222、0.7858、0.8761、1.5221、1.6449、1.6729

碱解

0.4689、0.6147、0.7766、1.1375、1.4352、1.5695

氧化

0.2424、0.2626、0.2899、0.3358、0.3833、0.3952、0.4294、0.5144、0.5612、0.6032、0.6531、0.6936、0.7276、0.7858、1.0891、1.4950、1.5221、1.5271、1.5372、1.5459、1.5588、1.5695、1.5727、1.6207、1.6263

光照

0.1669、0.1715、0.1777、0.1968、0.2076、0.2178、0.2513、0.3063、0.5144、0.5612、0.6032、0.6302、0.6531、0.6936、0.7222、0.7766、1.5221、1.5459、1.5588、1.6207

避光

0.6032、1.5221

加热

0.6032、0.6936、0.7766、0.7858、0.9771、1.0891、1.1375、1.3630、1.4462、1.4649、1.4950、1.5221、1.5459、1.5695、1.6609、1.6729、1.6972

高湿

0.5612、0.6032、0.6302、0.6936、0.7858、1.1375、1.5221、1.5459、1.5695、1.6207、1.6729

（三）、专属性

水解物单个专属性溶液：

精密称取水解物P13015.327mg于50ml容量瓶中，用乙腈：

水=1：

1溶解并定容至刻度。

β-异构体单个专属性溶液：

精密称取β-异构体P13015.930mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

脱水物单个专属性溶液：

精密称取脱水物P13015.380mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

达托霉素样品溶液：

精密称取达托霉素样品S13030125.78mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

混合溶液：

精密称取达托霉素样品S13030125.85mg于50ml容量瓶中，分别加入各单个专属性溶液5.0ml，用稀释剂溶解并定容至刻度。

分别进样空白溶液、各单个专属性溶液和混合溶液，考察空白溶液在各组分保留时间处是否存在干扰，相邻各组分间分离度，结果见表3。

表3专属性

理论塔板数≥2000

相邻组分间分离度≥1.0

达托霉素

单个组分保留时间（min）

29.697

31.783

35.068

39.943

混合溶液各组分保留时间（min）

29.725

31.777

34.776

40.028

相对保留时间（RRT）

0.85

0.91

1.0

1.15

与相邻前一个色谱峰间分离度

1.08

1.52

1.83

1.11

与相邻后一个色谱峰间分离度

1.73

1.36

3.00

2.72

理论塔板数

29805

32487

25316

44523

各组分间分离度和理论塔板数均满足认可标准，专属性良好。

（四）、定量限LOQ和检测限LOD

1、定量限LOQ

（1）、未知杂质定量限

精密称取达托霉素对照品P130125.39mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

1.0%对照溶液：

精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

未知杂质LOQ溶液：

精密移取1.0%对照溶液1.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-1。

表4-1未知杂质LOQ检测结果

LOQ浓度

峰面积

S/N

未知杂质

Conc:

0.0721µ

g/ml

相当于主峰浓度0.0144%

4.50242

12.0

4.20262

12.5

4.16507

12.1

4.38089

12.3

4.24095

11.0

6th

4.34012

13.7

4.30535

RSD%

2.94

RSD%≤5.0%，信噪比S/N：

10～15，LOQ≤0.05%

未知杂质LOQ浓度为0.0721µ

g/ml，峰面积RSD%为2.94%，信噪比均在10～15，均满足认可标准。

（2）、已知杂质定量限

水解物储备溶液：

精密称取水解物P13019.736mg于50ml容量瓶中，用乙腈：

水解物定量限储备溶液：

精密移取水解物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

β-异构体储备溶液：

精密称取β-异构体P13019.011mg于20ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

β-异构体定量限储备溶液：

精密移取β-异构体储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

脱水物储备溶液：

精密称取脱水物P130113.584mg于20ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

脱水物定量限储备溶液：

精密移取脱水物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

已知杂质定量限溶液：

分别精密移取水解物定量限储备溶液8.0ml、β-异构体定量限储备溶液5.0ml、脱水物定量限储备溶液3.5ml，置于同一100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-2～4-4。

表4-2水解物LOQ检测结果

0.0712µ

相当于主峰浓度0.0142%

2.98211

10.8

3.00327

10.6

3.01177

10.3

3.06674

10.2

3.03898

11.3

2.85349

2.99273

2.48

表4-3β-异构体LOQ检测结果

β-异构体Conc:

0.0810µ

相当于主峰浓度0.0162%

3.22056

3.19458

3.43469

11.5

3.29001

3.10069

12.4

3.14882

13.2

3.23156

3.67

表4-4脱水物LOQ检测结果

0.1029µ

相当于主峰浓度0.0206%

3.91158

3.83876

12.7

4.08405

3.99076

12.2

3.96843

4.01022

14.8

3.96730

2.13

水解物LOQ浓度为0.0712µ

g/ml，峰面积RSD%为2.48%；

β-异构体LOQ浓度为0.0810µ

g/ml，峰面积RSD%为3.67%；

脱水物LOQ浓度为0.1029µ

g/ml，峰面积RSD%为2.13%，信噪比S/N均在10～15，均满足认可标准。

2、检测限LOD

（1）、未知杂质检测限

未知杂质检测限溶液：

精密移取未知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

连续注射2针检测限溶液，计算信噪比S/N，结果见表4-5。

表4-5未知杂质检测限结果

LOD浓度

0.0216µ

相当于主峰浓度0.0043%

1.31658

3.4

1.23401

3.1

1.27530

S/N：

2～5

未知杂质LOD浓度为0.0216µ

g/ml，信噪比S/N均在2～5，满足认可标准。

（2）、已知杂质检测限

已知杂质检测限溶液：

精密移取已知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。

连续注射2针检测限溶液，计算信噪比S/N，结果见表4-6～4-8。

表4-6水解物检测限结果

0.0214µ

0.698758

2.5

0.882716

2.6

0.790737

表4-7β-异构体检测限结果

0.0243µ

相当于主峰浓度0.0049%

1.24539

1.11254

1.17897

表4-8脱水物检测限结果

0.0309µ

相当于主峰浓度0.0062%

0.949185

2.8

1.26179

2.7

1.10549

水解物LOD浓度为0.0214µ

g/ml，β-异构体LOD浓度为0.0243µ

g/ml，脱水物LOD浓度为0.0309µ

g/ml，信噪比S/N均在2～5，均满足认可标准。

（五）、线性

（1）、含量线性

200%线性储备液：

精密称取达托霉素对照品P130149.21mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。

线性溶液：

精密移取200%线性储备液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml，分别置于5个10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%线性溶液。

每份溶液进样2针，记录数据，做线性回归曲线，求相关系数R、截距百分比（截距/100%含量浓度对应的峰面积×

100%）。

结果见表5-1。

表5-1.达托霉素含量线性结果

R≥0.999

截距百分比≤3.0%

浓度（mg/ml）

平均峰面积

40%溶液

0.1864

8811.59668

8793.04639

8774.49609

80%溶液

0.3728

17491.2

17464.6

17438.0

100%溶液

0.4660

22034.8

22031.2

22027.6

120%溶液

0.5592

26455.8

26450.7

26445.5

160%溶液

0.7456

35709.7

35704.9

35700.0

线性方程

Y=48119x-341.5