生物技术布鲁氏菌Omp31bls融合基因重组表达载体的构建与诱导表达Word格式文档下载.docx
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融合PCR；
pET-28a载体
TheConstructionandInducedExpressionoftheRecombinantExpressionPlasmidpET-Omp31-bls
Abstract
Brucellosisisazoonosisnowadaysspreadingallovertheworld.ItiscausedbyasmallbacteriumcalledBrucellawhichisakindofGram-negativebacterium.TheBrucellacoulddirectlyparasitizeinhumanandanimalcells（especiallyinthereproductivesystemcells）,andthesymptomsofBrucellosisarefetaldeath,abortionandsterilityoflivestock.Intherecentyearsepidemicsituationbringsseriousharmtothedevelopmentofanimalhusbandryandhumanhealth.Therefore,Brucellosisisaseverethreattotheeconomyconstruction,publichealthandthenationalsecuritytoourcourtry.Prevention,controlandeveneradicationofbrucellosisarebecomingthemostpressingmattersofthemoment.
Inthisstudy,OMP31andBLS,whichareveryimportantproteinsinB.suis,weretakenasourreseachsubjects.Omp31wasfusedwithblsbythetechnologyofthefusionPCR,andthenconstructedarecombinantexpressionplasmidpET-Omp31-blscarryingthefusiongeneOmp31-bls.AftertransferringintothecompetentcellsoftheexpressionstrainTL129,thefusiongenewasinducedwithIPTG.TheresultsoftheexprimentshowedthattherecombinantexpressionplasmidpET-Omp31-blswascorrectlyconstructed,andtherecombinantproteinrOMP31-BLSwassuccessfullyexpressed.
Keywords:
Brucella;
BLS;
OMPs;
FusionPCR;
pET-28a
目录
摘要I
AbstractII
引言1
第一章文献综述3
1.1布鲁氏菌病的概况3
1.2病原学特征4
1.2.1布鲁氏菌种属及生物型4
1.2.2布鲁氏菌生物学特征4
1.2.3培养条件及特性5
1.2.4对理化因素的抵抗力5
1.3布鲁氏菌感染机制5
1.4布鲁氏菌疫苗发展史6
1.4.1减毒活疫苗6
1.4.2灭活疫苗6
1.4.3突变株疫苗6
第二章材料与方法9
2.1实验材料9
2.1.1应用菌株9
2.1.2质粒载体9
2.1.3酶试剂和化学试剂9
2.1.4主要仪器10
2.1.5实验试剂及配方11
2.2方法13
2.2.1引物设计与合成13
2.2.2目的基因片段（Omp3148-74）PCR扩增13
2.2.3目的基因片段（N端缺失27个碱基的bls）PCR扩增14
2.2.4融合PCR的扩增Omp3148-74-bls融合基因片段14
2.2.5pET-28a质粒载体的小量提取15
2.2.6pET-28a质粒载体的双酶切15
2.2.7pET-28a质粒载体双酶切后的胶回收16
2.2.8目的重组片段Omp3148-74-bls与pET-28a载体的酶连反应17
2.2.9感受态细胞的制备17
2.2.10重组载体pET-Omp3148-74-bls转化感受态细胞18
2.2.11菌落PCR筛选阳性重组子18
2.2.12pET-Omp3148-74-bls重组载体的双酶切19
2.2.13pET-Omp3148-74-bls重组质粒转化表达菌株TL12920
2.2.14重组质粒转化TL129后的PCR筛选阳性重组子20
2.2.15IPTG诱导rOMP3148-74-BLS重组蛋白质的表达20
2.2.16SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测21
第三章结果与分析22
3.1空质粒载体pET-28a的提取22
3.2空质粒载体pET-28a的双酶切22
3.3N端缺失27个碱基的bls基因的PCR扩增23
3.4目的基因片段Omp3148-74的PCR扩增24
3.5目的融合基因Omp3148-74-bls的PCR扩增24
3.6菌落PCR筛选阳性重组子25
3.7pET-Omp3148-74-bls重组质粒的双酶切26
3.8pET-Omp3148-74-bls重组质粒测序26
3.9重组质粒转化TL129后的PCR筛选阳性重组子26
3.10SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳验证27
第四章讨论28
4.1目的基因片段的选取28
4.2关键实验技术28
4.3诱导表达分析28
第五章结论29
参考文献30
致谢32
引言
到目前为止，疫苗对于布鲁氏菌病疫情的防治仍然发挥着非常重要的作用，如Rev.1（源于羊型布鲁氏菌）致弱活菌苗与M5（源于羊型布鲁氏菌）活菌苗对于绵羊、山羊布鲁氏病疫情仍然是最有效的。
但因为这些疫苗容易返祖、影响接种动物以及安全问题不易控制等方面的缺点，使得人们不得不迎接挑战，继续寻找安全、有效、无副作用新型疫苗。
几年来随着分子生物学和生物化学的快速发展，亚单位疫苗的研究似乎成为了布鲁氏菌疫苗研究的热点方向，研究表明，暴露在布鲁氏菌表面的OMP31蛋白分子以其很强的保守性以及几乎存在于所有的布鲁氏菌属中的原因成为了布鲁氏菌免疫研究的热点。
OMP31可以引起强烈的免疫反应，并且发现OMP31的48-74位氨基酸残基也有免疫原性和对菌体的保护性，可以作为亚单位疫苗的靶分子。
布鲁氏菌的一种细胞质蛋白——蝶啶合成酶（BLS）能引起非常强烈的免疫原性反应[1]，其分子的四级结构呈机密排列的十聚体形式存在。
利用结构分析和N端缺失突变体显示[2,3]，去掉BLSN端9个氨基酸并在缺失位置插入外源多肽片段。
可能不会改变BLS原有的构象而能形成呈十聚体的重组蛋白，BLS在此起到聚合抗原决定簇的作用，从而大大提高免疫反应对这个插入肽的免疫对抗程度[4-6]。
在研究中，我们可以将OMP31的48-74位氨基酸插入到N端缺失9个氨基酸的缺失位置上。
如果重组后的蛋白仍然保留原来的BLS十聚体的构想的话，那么一个十聚体的重组蛋白分子就会携带有十拷贝的OMP31抗原决定簇，从而扩大了插入肽OMP31的免疫原性。
图1.1构建得到的融合蛋白示意图
因此，实验过程中我们可以将携带有Omp31-bls融合基因的原核质粒载体转化到表达菌株TL129中，从而诱导重组蛋白rOmp31-BLS表达，最后进行重组蛋白电泳检测验证。
图1.2实验技术路线图
第一章文献综述
1.1布鲁氏菌病的概况
布鲁氏菌病（Brucellosis简称为布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的，该病是目前世界上危害最大，流行甚广的传染性疾病之一[7]。
而且，可以引起患病动物不孕、流产和死胎等症状；
它已经被我国确定为二类动物传染病。
目前，世界上约200个国家和地区中，已报告有布病疫情的近170个[8]。
据统计，全世界布病患者约有500－600万人，每年直接造成的经济损失会高达数十亿多美元。
而且，此病还对人类健康造成非常严重的威胁；
每年新发病人数为50多万，如图3全世界布鲁氏菌病疫情的分布状况。
图1.3世界布鲁氏菌病疫情分布
1886年英国军医Bruce在马尔他岛进行研究，他从死于马尔他热的士兵的脾脏中，用显微镜看到了一种小型的细菌，1887年他又进一步对死亡士兵的部分脾脏进行了细菌培养实验，经培养分离出一种微小细菌，证明了在士兵之间传播的这种不明“波浪热”疾病是由这种细菌引起，在当时被称为马尔他微球菌（Micrococcussmelitensis）。
自从分离出了第一株布鲁氏菌到现在，在近百余年里，人们对布鲁氏菌细菌本身的认识也在逐渐加深，尤其是近十年来，随着现代分子生物学和免疫学等各种学科的发展，人们对布鲁氏菌属内的诸多奥秘也不断被揭示出来。
我国早在1905年就有布鲁氏菌病的报道[9]，目前我国人畜间布鲁氏菌病也波及到了28个省市、自治区和直辖市。
且在各个省市区的人畜患病程度各有不同。
图1.4我国历年布鲁氏菌病发病趋势图
因此，世界动物卫生组织（OIE）将布鲁氏菌病列为B类严重传染病。
在我国，中华人民共和国传染病防治法将该病列为乙类传染病。
是OIE规定的，必须强制报告的动物疫病之一。
1.2病原学特征
1.2.1布鲁氏菌种属及生物型
布鲁氏菌共有6个种[10-12]，分为20个生物型。
其中包括：
牛型布鲁氏菌（Brucellaabortus，流产型）有9个生物型；
羊型布鲁氏菌（Brucellamelitensis，马尔他型）有3个生物型；
猪型布鲁氏菌（Brucellasuis）有5个生物型；
此外，绵羊附睾型布鲁氏菌（Brucellaovis，绵羊型）、犬型布鲁氏菌（BrucellaCaris）以及沙林鼠型布鲁氏菌（Brucellaneotomae）各有1个生物型；
目前为止我国已分离出了15个生物型，分别为羊型布鲁氏菌3个型，牛型布鲁氏菌8个型，猪型布鲁氏菌的2个型（1型和3型），绵羊附睾型布鲁氏菌和犬型布鲁氏菌各1个型。
布鲁氏菌以羊、牛、猪三种的研究意义最为重要，其中以羊型布鲁氏菌的致病性最强。
1.2.2布鲁氏菌生物学特征
布鲁氏菌属的细菌是一组小型的球或杆状的革兰氏阴性菌[13,14]。
宽0.3-0.6μm，长0.6-1.5μm。
无芽胞、无鞭毛、不形成荚膜。
布鲁氏菌在初次分离培养时为小球杆状菌，然后通过多次的传代后，牛型布鲁氏菌和猪型布鲁氏菌就会渐渐变为小型杆状，只有羊型布鲁氏菌还保持原来的形态。
布鲁氏菌的细胞膜是一个三层膜结构[15,16]，由内向外观察发现，最内层为细胞质膜，次外层为外周胞质膜，最外层为外膜。
外膜不仅含有蛋白质、磷脂层，而且含有脂多糖（LPS）成分，与肽聚糖（PG）层紧密结合组成细胞壁。
根据脂多糖是否含有O-链，可以将布鲁氏菌分为光滑型（S）与粗糙型（R）2种。
光滑型布鲁氏菌的脂多糖含有O-链，而粗糙型布鲁氏菌的脂多糖缺少O-链。
布鲁氏菌毒性强弱与其外膜中脂多糖和外膜蛋白（OMPs）有关，光滑型布鲁氏菌毒力明显高于粗糙型布鲁氏菌。
粗糙型布鲁氏菌表面缺乏或者缺失光滑型菌的脂多糖，因此粗糙型菌为低毒或无毒菌。
除猪型布鲁氏菌4、5生物型，和绵羊、犬型布鲁氏菌为粗糙型菌落外，其余均为光滑型菌落。
1.2.3培养条件及特性
布鲁氏菌属需氧菌，对营养条件较为苛刻，并且生长比较缓慢，牛型布鲁氏菌的几种生物型的初代培养，需要在5％-10％CO2条件下才能生长[15]。
强毒的光滑型菌落，经过人工培养基长期多次传代培养，特别是在液体培养基培养情况下，易发生S→R的变异。
天然粗糙型菌和发生了S→R变异的菌株一样，均丧失了O抗原而暴露出非特异性的R-LPS表面抗原，其毒力也会有所减弱。
1.2.4对理化因素的抵抗力
布鲁氏菌在自然界中分布广泛且抵抗力较强[17]。
在水中能存活70-100d，在土壤中能存活20-120d，在粪尿中能存活45d，在肉、乳类食品中可存活60d，在动物毛皮上能存活150d。
但布鲁氏菌对理化因素的抵抗力较差，对它有多种杀灭的方法：
65℃15min，70℃5min即可灭活，煮沸立即灭活。
阳光直射20min即可被杀死。
除高温高热外，布鲁氏菌还对多种消毒液和抗生素类药物极敏感，2％甲醛180min灭活，5％石灰水120min灭活，2％石碳酸和来苏儿、0.1％升汞水60min可灭活，0.01％苯酚、0.5％洗必泰5min灭活。
1.3布鲁氏菌感染机制
布鲁氏菌通常是通过粘膜来进入机体并感染细胞的（特别是生殖系统细胞）。
当布鲁氏菌遇到巨噬细胞是，就会被巨噬细胞所吞噬，但因为其荚膜具有特殊的保护性作用。
不但不能被消灭掉，反而可以寄生在巨噬细胞内进行增殖。
过一段时间，待增殖到一定数量后就会转移到淋巴细胞中继续增殖。
当突破外边的屏障进入机体血液中时，自身分泌的一些毒素会被释放，从而引起机体出现许多症状。
最常见的是全身发热的病症，当布鲁氏菌进入其他器官中如生殖器官中时，原来出现的各种病症也就随之消失了。
当布鲁氏菌重新进行迁移时又会出现相同的症状，如此反反复复，临床上把这种现象称为“波浪热”，另外还有流产、死胎、不孕等症状。
据统计：
感染羊型布鲁氏菌没有得到很好的医治一般会出现高达2%死亡率。
1.4布鲁氏菌疫苗发展史
1.4.1减毒活疫苗
目前减毒活疫苗[18,19]在防治布鲁氏菌病疫情方面仍占有很大的比例，如我国自主研制的羊型5号（M5）弱毒活菌苗和猪型2号（S2）弱毒活菌苗都是被世界各国认可并引用的优秀菌苗。
之所以这样，因为这两种菌苗不但价格低廉，而且持续时间长，效果非常好。
1.4.2灭活疫苗
1.4.2.1牛型45/20
由于以前的菌苗的诸多缺点，因此科学家正在积极进行新育苗的研究工作。
1922年牛型45/20被研制出，该菌苗是从一头被布鲁氏菌感染的奶牛运用分离技术被分离出的，经过在豚鼠体的细胞中数次传代后并最终获得了一种粗糙型且为减毒的疫苗称为“牛型45/20”。
这种疫苗有很多缺点，例如稳定性极弱，并且很容易返祖，造价高等缺点，限制了这种疫苗的广泛运用。
1.4.2.2羊型53H38死菌佐剂苗
这种菌苗是Renoux等人于1964年研究出的成果，他们将马耳他布鲁氏菌进行培养，然后加入福尔马林灭菌后和佐剂，相互混匀后制成的，这种菌苗的效果比较好，特别是对山羊和绵羊的身上效果更加明显。
他与19号比起来效果优越，但是经测试其效果与ReV.1菌苗效果相近。
此菌苗相对安全性较好，但是可能会对局部机体有所作用，有学者将此苗通过化学键与特异性抗体相连，但可惜的是在减少凝集力的同时也降低了此苗的抗原性。
因此此苗的免疫效果也是不尽人意，最终以失败而告终。
1.4.3突变株疫苗
1.4.3.1RB51突变株疫苗
前面介绍了有关牛型45/20疫苗是典型的粗糙型菌株，且具有明显的保护性，此菌苗的优点是他并不会产生任何抗O-链的抗体，说明了粗糙性的菌苗也可以作为布鲁氏菌疫苗的实验室研究相关材料。
所以我们希望通过对粗糙型菌株的研究获得具有较多优点的新型菌苗。
1991年，名为RB51的菌苗被Schurig等人研制成功。
这里的RB51中R是rough（粗糙型），B是Brucella（布鲁氏菌）；
51是此菌苗被分离出来的时间。
此菌苗可以通过普通培养基进行分离，也可以应用其他方式进行分离。
由于菌苗本身缺少O-连的原因，所以此菌苗不会引起O-连抗体的产生。
此菌苗有很多优点，例如不会在机体或者细胞内引起变异反应，不会引起动物流产等毒副作用以及可以在很短的时间里被排除掉。
此菌苗与19号菌苗相比结果显示效果很相近。
截至目前为止，50万头牛已经应用该疫苗进行了免疫接种，观察结果显示期间无任何不良反应，实验中采用1×
1010—3.4×
1010个细菌的计量进行注射测试。
田间实验测试采用1×
109计量对动物进行皮下免疫，也不会引起母畜的流产的现象。
田间实验意外发现，免疫过RB51的小鼠后，再以其它的布鲁氏菌进行侵染，发现该小鼠在免疫其他布鲁氏菌菌种方面效果也大大增强了。
此后，对其它动物和母畜进行相同的免疫实验，结果显示相同，因此得知RB51是免疫效果相对较好的疫苗。
然而该疫苗还有其它的缺陷性，如它对绵羊体内的免疫反应则无任何效果。
这种疫苗的免疫过程目前还不为人知，但是惊讶的是将该菌苗对小鼠和牛进行口服也能够引起机体的相应的免疫保护作用。
经田间实验结果显示此菌苗独立比较稳定，但是对其变异性还不确定。
1.4.3.2VTRM1和VTRS1
1996年成功研制出了疫苗VTRM1和VTRS1，这两种菌苗是应用以前RB51的相关方法研制而成。
对小鼠的进行实验室测试发现这两种菌苗的免疫效果比RB51菌苗高，经过许多方面的研究发现，布鲁氏菌中还有其它相关基因对其毒力有很大的贡献。
之所以被免疫的动物具有了对布鲁氏菌的抗性，是因为VTRM1和VTRS1菌苗提高了机体对抗布鲁氏菌的免疫力。
经实验室测试VTRM1和VTRS1对动物的免疫效果比RB51高出许多，分析其原因，可能是它们在机体中繁殖较快的原因，引起机体免疫性增强，并且免疫的时间也相对较长些。
虽然VTRM1和VTRS1有诸多的优点，但其返祖的现象还是令人们担忧，因为如果其返祖，那么将造成不可挽回的后果。
1.4.3.3重组蛋白疫苗
近来研究者们希望从布鲁氏菌中提取有效蛋白质如细胞质蛋白（如BLS）、外膜蛋白（如OMP31、OMP15.6等）以及LPS等，与理想的佐剂配合，免疫动物，然而效果并不理想。
近些年来随着分子生物学技术的不断提高，以及对布鲁氏菌内相关分子的结构和功能了解的越来越多。
经实验研究发现了许多外膜蛋白[20]。
截至目前，随着布鲁氏菌的全部基因组解开了其神秘的面纱后，研究者们开始应用基因工程的手段来研究安全、有效、无毒副作用的理想疫苗了。
研究表明机体对于布鲁氏菌的反应主要是细胞免疫，因此我们只要针对细胞免疫的方向就可以了。
近来人们把注意力放到了亚单位疫苗的研究方向上，如利用一些布鲁氏菌的一些外膜蛋白如（OMP31）与一些具有凝聚作用和呈递作用的分子（如BLS）蛋白质重组，构成重组蛋白质。
这样一来不仅可以构建出亚单位疫苗来免疫动物，还可以探究布鲁氏菌基因组中引起免疫反应较显著的的抗原表位基因。
通过一些学者们的实验，也取得了一些比较惊人的成绩。
如本实验研究的对象就是布鲁氏菌的一种外膜蛋白OMP31及细胞质蛋白BLS，并将相应的基因基因重组的方式构建成融合基因，然后诱导重组蛋白的诱导表达，最终为构建多克隆抗体奠定基础。
第二章材料与方法
2.1实验材料
2.1.1应用菌株
猪型布鲁氏菌病S2减毒活菌苗购自包头市防疫站——该菌苗是布鲁氏菌猪型2号弱毒菌株看，将该菌接种适宜培养基培养，培养物加稳定剂后，经真空冷冻干燥制备而成。
实验中所用的S2菌液是由猪型布鲁氏菌病S2减毒活菌苗活化制备。
克隆菌株DH5α和表达菌株TL129由本实验室保存。
2.1.2质粒载体
原核载体pET-28a全长5369bp，具有T7启动子，其上含有编码六聚组氨酸（his-tag）蛋白的标签。
2.1.3酶试剂和化学试剂
（1）EcoRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶，T4DNA连接酶，1KbDNALadderMarker、100bpLadderMarker、TritonX-100、蛋白酶K、LordingBuffer：
宝生物工程（大连）有限公司。
（2）聚合酶及PCR相关试剂：
南京博尔迪生物科技有限公司。
（3）胰化蛋白胨，酵母提取物：
OXOIDLTD，BASINGSTOKE，HAMPSHIRE,ENGLAND。
（4）牛肉汤培养基：
中国陆桥技术有限公司。
（5）NaCl：
天津市盛奥化学试剂有限公司。
（6）琼脂，甘氨酸：
Japan。
（7）葡萄糖，NaOH：
天津市风船化学试剂科技有限公司。
（8）EDTA：
天津永晟精细化工有限公司。
（9）SDS，甲叉双丙烯酰胺，IPTG，TEMED，丙烯酰胺，Kana：
AMRESCO。
（10）醋酸钾，HCl：
天津市科盟化工工贸有限公司。
（11）琼脂糖：
GENEtechcompanylimited。
（12）低熔点的琼脂糖：
BIOBASICINC。
（13）甘油（丙三醇），醋酸钠，CaCl2，异戊醇，冰乙酸，硼酸：
天津市化学试剂三厂。
（14）氯仿（三氯甲烷）：
天津市北方天医化学试剂厂。
（15）引物：
由上海生工生物工程有限公司合成。
（16）溴酚蓝：
天津市光复精细化工研究所。
（17）β-巯基乙醇：
天津市华东试剂厂。
（18）甲醇，过硫酸铵（APS）：
天津市凯通化学试剂有限公司。
2.1.4主要仪器
（1）冷冻离心机：
Centrifuge5804R、Centrifuge5810R，eppendorf公司。
（2）制冰机：
XB70型GrentautomaticICEmachne，宁波格兰特制冷设备制造有限公司。
（3）电泳仪：
DYY-2C型稳压稳流电泳仪。
（4）台式离心机TGL-16c：
上海安亭科学仪器厂。
（5）立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50：
上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
（6）微量移液器：
金花牌微量移液器。
（7）水浴锅：
HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司。
（8）SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：
苏州净化设别有限公司。
（9）宏图通风橱：
包头宏
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