一巨噬细胞吞噬功能Word文件下载.docx
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3.以Hank’s液洗涤MΦ，1000rpm离心5min，重复二次。
4.计数MΦ，以Hank’s液配制1×
106个/ml细胞悬液。
5.取华氏管，加入等量的1×
106个/ml的MΦ悬液及1×
107/ml白色念珠菌菌液。
6.37℃，温育30min（中间摇动试管二次）。
7.500rpm离心5min，弃上清液。
8.轻轻振荡试管，取悬液一滴加至载玻片，取冷美兰一滴，混匀后，
加盖玻片。
9.高倍镜观察并计数。
四、结果判断
1．计算方法
（1）吞噬百分率=×
100%
（2）吞噬指数=×
（3）杀菌率=×
（杀死的细菌呈蓝色，活菌不着色）
2．正常值：
（1）吞噬百分率：
62.77±
1.38
（2）吞噬指数：
1.058±
0.049
（3）杀菌率：
因激活条件、观察计数时间的不同而表现不同（计算杀菌率应减去白色念珠菌的自然死亡率）。
五、注意事项
1.吞噬用的白色念珠菌菌龄应在18～24h内，不能有假菌丝及出芽现象。
2.MΦ数与白色念珠菌数要计数准确，温育时其比例为MΦ：
白色念珠菌=1：
10。
3.温育时要摇动2～3次，以免MΦ与白色念珠菌沉于管底。
实验二抗体的常规检测
抗原与相应抗体相遇，可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀。
此原理可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）。
实验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应。
一、凝集反应
直接凝集反应是指颗粒性抗原（如完整的细菌或细胞）与相应抗体在体外直接结合而出现的凝集反应。
直接凝集反应又可分为：
玻片凝集和试管凝集。
（一）玻片凝集实验（人ABO血型鉴定）
是用已知抗体与未知颗粒性抗原在玻片上直接结合而出现的凝集反应。
这类反应较简单、迅速，常用于抗原或抗体的定性检测。
例如细菌的鉴定、分型及ABO血型鉴定。
这里介绍人类的ABO血型鉴定方法。
1.原理
ABO血型系统是按照血液中红细胞表面的抗原分子来命名的。
人类ABO血型抗原有两种:
A抗原和B抗原。
A型血红细胞表面有A抗原，B型血红细胞表面有B抗原，AB型血红细胞表面有A、B两种抗原，若红细胞表面无这两种抗原，则为O型血。
若用已知的抗A血清和抗B血清与受试者红细胞上的相应抗原结合，即可能引起红细胞凝集，据凝集状况便可判定出受试者的血型。
2.材料
（1）标准抗A血清、抗B血清。
（2）玻片、酒精、碘酒、无菌三棱采血针、无菌木棒、无菌棉棒。
3.方法
（1）取洁净载玻片1张，用蜡笔分为2格，注明A、B字样。
（2）倒置标准抗血清试剂瓶，悬空轻挤出抗A血清1滴，滴加在A格内；
同法在B格内加抗B血清1滴。
（3）消毒左手无名指指尖，待酒精自然干燥后，用无菌采血针快速刺破皮肤。
（4）用木棒的两端取血，分别在抗A血清和抗B血清中搅拌混匀。
（5）无菌干棉球压迫手指止血。
（6）静置玻片数分钟，在白色背景下观察凝集结果。
4.结果判断
混合液由红色均匀浑浊逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，为红细胞凝集。
混合液仍呈均匀浑浊，则未发生凝集。
根据结果可判断血型。
表2-1血型的判断
血型
抗血清
A
B
AB
O
抗A血清
+
-
抗B血清
5.注意事项
（1）载玻片标明A、B，不要让两种抗血清混合。
（2）采血前要消毒手指，在酒精干燥前不要采血，以免酒精破坏红细胞。
（3）木棒的两端不可混用。
（4）及时观察结果。
（5）对被血液污染的用品在废弃前，要定点放置，集中进行严格的消毒，以防传播疾病。
例如，沾血的载玻片浸泡在84消毒液中，木棒、采血针、棉球要高压处理。
（二）试管凝集实验
此次实验是以定量的伤寒菌为抗原，根据是否发生凝集反应，来检测血清中是否含有对应的抗体；
并根据各管凝集程度的不同，来判断抗体的效价。
应用此原理可帮助临床诊断和判断病人的病程、预后等。
（1）灭活的伤寒菌液（7108/ml）
（2）待检的动物血清（经伤寒“H”免疫）
3.方法:
（1）取试管6支,用红笔标记好顺序.依次放在试管架中。
（2）于第1管内加生理盐水0.9ml,其余各管加生理盐水0.5ml。
然后在第一管中加入伤寒免疫血清0.1ml，用吸管将它与生理盐水吹打混匀后，取出0.5ml加入第二管中；
再将第二管中的液体吹打混匀，取出0.5ml加入到第三管中，其余各管都照此方法将血清对倍稀释。
至第5管时，将试剂混匀后，取出的0.5ml弃去不用。
使第6管不含伤寒免疫血清，作为试验的阴性对照管。
最后在各管中都加入0.5ml伤寒菌液。
加样量如表所示：
表2-2试管凝集试验的加样表（单位：
ml）
试管号
1
2
3
4
5
6
生理盐水
0.9
0.5
伤寒免疫血清
0.1
弃0.5
伤寒菌液
血清最终稀释度
1∶20
1∶40
1∶80
1∶160
1∶320
对照
（1）轻摇试管架，混匀试管内液体,56℃水浴12h,观察结果。
4.结果
（1）对照管（第6管）:
上清液浑浊,管底可有沉淀的细菌,轻摇后分散呈均匀浑浊。
（2）实验管:
按1-5管依次观察。
阳性者管底有不规则凝集物,较松散。
阴性者与对照管相同.
（3）凝集程度的判断:
++++:
液体澄清透明,细菌全部凝集于管底,轻摇可见大的凝集块.
+++:
液体稍混,细菌大多数凝集于管底，摇动后凝块较前者小。
++：
液体中等浑浊,液体中有明显的凝集物,凝集块较小。
+:
液体混浊，仔细观察可以看到液体中有很小的凝集颗粒。
-:
与对照管相同。
（4）判断凝集效价.
出现明显可见凝集物（++）时的血清最高稀释度为血清效价。
5.注意事项:
（1）试管要作标记，不同试剂的吸管勿交叉混用。
（2）在对倍稀释伤寒免疫血清时，要混匀后再加入下一试管。
（3）加样要准确，避免有气泡干扰。
（4）加样后要轻摇混匀，再进行水浴。
（5）水浴时避免水滴落入试管内，影响结果。
（6）实验结束时，小心轻取出试管，以免凝集物分散，影响观察。
（7）先观察对照管的结果，判断实验可信性；
然后观察实验管。
（三）间接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体的反应可用直接凝集来定性、定量。
而可溶性抗原与相应抗体的反应不能发生肉眼可见的直接凝集现象。
借鉴直接凝集反应的原理，把可溶性抗原附加在颗粒性物质-载体上，使之成为人工的颗粒性抗原，然后与相应的抗体混合，观察间接凝集现象。
间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在与免疫无关,有一定大小的颗粒性物质（载体）上,然后再与相应抗体（或抗原）反应而出现的凝集反应。
常用作载体的物质有红细胞、聚苯乙烯胶乳颗粒、金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）等。
根据载体的不同，间接凝集反应可分为血凝抑制试验、胶乳凝集试验、协同凝集试验等。
本文只介绍用于诊断妊娠的胶乳凝集试验。
胶乳凝集抑制试验
以聚苯乙烯胶乳颗粒作为载体，抗原致敏的胶乳颗粒与相应抗体结合能发生凝集。
如果先将抗体与可溶性抗原作用，然后加入抗原致敏的胶乳颗粒，则不出现凝集，称为胶乳凝集抑制试验。
妊娠妇女尿液中含有人绒毛膜促性腺激素（Thehumanchorionicgonadotropin,HCG），将待测尿液与抗HCG的血清混合，该尿液中的HCG与抗血清结合，消耗了抗HCG血清。
然后加入HCG致敏的胶乳颗粒，无抗HCG血清与之反应，不能发生凝集，为妊娠试验阳性。
如果待测尿液中没有HCG，则致敏胶乳颗粒与抗HCG血清结合，发生凝集，称为妊娠试验阴性。
（1）HCG致敏的胶乳抗原
（2）抗HCG的血清
（3）妊娠妇女尿与未妊娠妇女尿。
（4）妊娠试验板，滴管。
3.方法
（1）在试验板的相邻两孔中分别加入1滴妊娠妇女尿和未妊娠妇女尿。
（2）在上述两孔中分别悬空加入1滴抗HCG的血清，轻摇混匀1-3min。
（3）在上述两孔中分别悬空加入1滴致敏胶乳抗原，轻摇混匀1-3分钟，观察结果。
出现白色细小凝集颗粒者为妊娠试验阴性，不出现凝集者呈白色混浊液，为妊娠试验阳性。
（1）标本和试剂应按顺序加入。
（2）滴加抗HCG血清和胶乳抗原时应悬空加入，以免污染试剂。
（3）加入试剂时液滴大小应均匀。
二、沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合，在一定条件下出现沉淀线/环的现象，称为沉淀反应。
常用的沉淀反应有环状沉淀反应、絮状沉淀反应、琼脂扩散及免疫电泳等。
琼脂扩散试验是指可溶性抗原与抗体在琼脂内扩散，若两者对应且比例适当，则出现白色沉淀线/环。
琼脂是大分子多糖，100℃时熔化，45℃以下凝固而形成网状结构，允许抗原抗体分子在其中自由扩散。
琼脂扩散试验又可分为单向和双向扩散，只有抗原或抗体扩散的试验称为单向扩散，可用于定量检测；
抗原与抗体都发生扩散的试验称为双向扩散，常用于定性检测。
（一）单向琼脂扩散试验
1、原理
单向琼脂扩散试验是定量试验，通常是用已知抗体测定未知抗原。
试验中将定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，制成含抗体的琼脂板，凝固后打孔。
再将待检抗原加入孔内。
因抗体与琼脂混合凝固，抗体的浓度均匀，只有孔中抗原向四周扩散，离孔愈远浓度愈低，这样在抗原、抗体比例合适处形成白色沉淀环。
由于只有抗原扩散，故称之为单向扩散。
观察结果可发现，在同样的反应条件下，沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应形成的沉淀环的直径为纵坐标，以抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。
量取待测抗原出现的沉淀环直径，从标准曲线中即可求得其含量。
本试验可用于检测标本中各种免疫球蛋白或血清补体含量。
2、材料
（1）人免疫球蛋白IgG的诊断血清（冻干羊抗人IgG）
（2）人免疫球蛋白标准血清，待检人血清。
（3）琼脂、玻片、打孔器、加样器、湿盒、37℃恒温箱等。
3、方法与结果
（1）制板：
按抗血清效价的一半，用56℃预热的生理盐水稀释抗血清，再加入等量的冷却至56℃的琼脂轻轻混匀。
在微波炉里加热至熔化后，用5ml吸管吸取3ml含抗血清的琼脂均匀加到玻片上，凝固后放4℃冰箱5min。
（2）打孔：
以打孔器打孔，孔径3mm,孔距1cm,每板2排，每排5个孔。
（3）按说明书要求稀释标准血清与待检血清。
待检血清1:
50稀释，标准血清系列稀释至1:
12.5，1:
25，1:
50，1:
100，1:
200。
（4）加样：
用微量加样器在第一排孔中依次加入不同稀释度的人标准血清10µ
l,第二排相邻孔中加待检血清各10µ
l。
（5）将琼脂板放入湿盒，37℃24h后测各沉淀环直径。
（6）以沉淀环直径为纵坐标，相应孔的IgG含量为横坐标，在半对数纸上制作标准曲线。
根据待检血清沉淀环直径查标准曲线，将查得的IgG含量乘以标本的稀释倍数，即为待检血清中的IgG含量。
4、注意事项
（1）灌板时，要将抗血清56℃预温，与冷却至56℃的琼脂混匀后，迅速灌板，避免气泡。
（2）加样时避免碰坏孔壁。
（3）孔间距不能小于1cm。
（二）双向琼脂扩散试验
双向琼脂扩散试验是定性试验。
将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，两者均可扩散，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。
如果不是相应的抗原与抗体，就不出现沉淀线。
本试验常用于分析抗原抗体的纯度及相互关系。
（1）羊抗人IgG标记为Ab，待测抗体标为抗原1、抗原2。
（2）生理盐水配制的1%琼脂。
（3）玻片、打孔器、湿盒、37℃恒温箱等。
将熔化的1%琼脂加在玻片上，3ml/板。
待琼脂凝固后，在板上打孔。
（3）加样：
如图所示，中央孔加抗体，上下孔加抗原1，左右孔加抗原2，每孔10µ
（4）将琼脂板置于湿盒内，37℃24h后观察结果。
Ag1
Ag2Ag2
图2-3加样示意图
中央孔加Ab，上下孔加抗原1、左右孔加抗原2。
在中央孔与周围孔之间，如出现沉淀线，则为阳性反应，提示有相应抗体与抗原反应。
如无沉淀线出现，则为阴性反应，说明抗体与抗原不相对应。
（1）琼脂铺板应一次铺成，均匀平滑。
（2）加样时，对准孔倒置滴管，轻挤出液体，避免量多溢出，影响沉淀线的形成。
三、补体结合试验
补体无特异性，可与任何抗原抗体复合物结合而被激活，但不能与单独的抗原或抗体结合。
补体结合试验（complementfixationtest,CF）是一种有补体参与，以绵羊红细胞（sheepredbloodcell,SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应体系。
绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体，导致红细胞破坏，出现溶血现象。
参与补体结合反应的五种成分可分为两个系统：
①待检系统：
已知抗原（或抗体）、待检抗体（或抗原）；
②指示系统：
SRBC、溶血素。
待检系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待检系统中的抗原抗体相对应；
两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合试验阳性。
反之，若出现溶血，则为补体结合试验阴性。
（一）预备试验
1.溶血素单位滴定
材料
（1）2%绵羊红细胞：
取新鲜脱纤维的羊血，用生理盐水洗两次后，配成2%浓度备用。
（2）溶血素：
用绵羊红细胞免疫动物后制备的动物血清。
（3）补体：
取新鲜豚鼠血清作1:
30稀释，冰箱保存备用。
（4）其它：
生理盐水、试管、吸管、37℃水浴箱。
方法：
（1）按照表3-1,于各管中分别加入不同稀释度的溶血素0.2ml，然后加入其它成分。
（2）充分混匀后，置37℃水浴30min，观察结果。
（3）凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为1个单位。
表中的试验表明，第11管（即1:
9600倍稀释）0.2ml溶血素为1个单位。
试验时常用0.2ml中含2个单位溶血素单位的稀释液（即1:
4800倍稀释），配制时可取1:
100倍的溶血素1ml加生理盐水（normalsaline，NS）47ml。
表2-4溶血素滴定（单位：
试管号溶血素（稀释度）补体（1：
30）生理盐水2%SRBC结果
10.2（1:
1000）0.20.40.2完全溶血
20.2（1:
1200）0.20.40.2完全溶血
30.2（1:
1600）0.20.40.2完全溶血
40.2（1:
2000）0.20.40.2完全溶血
50.2（1:
2400）0.20.40.2完全溶血
60.2（1:
3200）0.20.40.2完全溶血
70.2（1:
4000）0.20.40.2完全溶血
80.2（1:
4800）0.20.40.2完全溶血
90.2（1:
6400）0.20.40.2完全溶血
100.2（1:
8000）0.20.40.2完全溶血
110.2（1:
9600）0.20.40.2完全溶血
120.2（1:
12800）0.20.40.2大部分溶血
130.2（1:
16000）0.20.40.2不溶血
对照--0.20.40.2不溶血
2．补体单位滴定
（1）补体：
1:
30稀释（同溶血素滴定）。
（2）2单位溶血素。
（3）2%绵羊红细胞（同溶血素滴定）。
（4）其他（同溶血素滴定）。
方法与结果
（1）按表2中各管加入1：
30稀释的补体。
（2）依次加入其它成分于每管中，混匀后置37℃水浴1530min后观察结果，判定补体单位。
（3）补体单位
凡能使一定量红细胞发生完全溶解的最小补体量，称为1个确定单位。
如下表中自第3管开始出现完全溶血现象，因此第3管（0.1ml）所含补体量为1个确定单位。
由于在实际应用时补体有一部分损失及活性降低，故通常取其次高一管补体量称为一个实用单位。
例如，下表中第4管（0.12ml）为1个实用单位，可以表示为：
1个确定单位=0.1ml1：
30稀释的补体
1个实用单位=0.12ml1：
30稀释的补体
（1）补体的稀释
若使每0.2ml补体含2个实用单位，可按下式计算：
30:
（20.12）=X:
0.2
X=300.2/20.12=25
即将补体原液稀释25倍，用0.2ml即可。
表2-5补体单位滴定（单位：
试管
补体（1:
30）
NS
溶血素（2单位）2%SRBC
结果
0.06
0.54
37℃水溶15-30min
37℃水浴15-30min
不溶血
0.08
0.52
稍溶血
0.10
0.50
全溶血
0.12
0.48
0.14
0.46
0.16
0.44
7
0.18
0.42
8
0.60
（二）正式试验
1．材料：
豚鼠血清按上述补体单位滴定结果稀释。
（2）抗原：
伤寒菌液10亿个/ml,煮沸2h,离心3000rpm,30min,吸取上清作为抗原，实验前作抗原滴定，用4个单位的抗原。
（4）待检血清：
56℃30min灭活后，1:
5稀释。
溶血素2个单位。
（5）2%绵羊红细胞（SRBC）
2.方法：
（1）取5支试管，依次做好标记,放在试管架中。
（2）按照下表加样。
表2-6补体结合试验（单位：
待检血清
抗原
补体
溶血素
SRBC
1（试验管）
－
摇匀
37℃
水浴
15min
2（血清对照管）
溶血
3（抗原对照管）
4（补体对照管）
0.4
5（SRBC对照）
0.8
3．结果判定：
第2-5均为对照管，具有不同的对照意义，应分别出现溶、溶、溶、不溶，说明反应条件和材料的可信程度。
第1管为试验管，不溶血为补体结合试验阳性（+），溶血为补体结合试验阴性（-）。
4．注意事项：
（1）羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈震荡引起溶血。
（2）各种试剂的吸管不要混用。
（3）补体性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱取出。
（4）水浴时避免水滴进试管。
（5）本试验影响因素很多，对照管的反应情况是否正常是判断试验可信的参照。
实验三酶联免疫吸附实验（ELISA）
ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）,由VanWeeman和Schuur以及Enyvall和Perlmann同在1971年报道并确立。
酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体成抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。
先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。
测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。
用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。
然后加入酶的作用底物催化显色，根据酶底物颜色的有无或深浅进行定性或定量测定。
酶联免疫吸附实验将抗原抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来，具有灵敏度高、特异性强、快速方便等优点，是免疫学技术中应用最广的方法之一。
二、方法简介
根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。
1.间接法——用于检测抗体（如图3-1）
⑴将已知抗原吸附固相载体，温育后洗涤。
⑵加入待测标本（第一抗体），温育后洗涤。
⑶加入酶标记的二抗，温育后洗涤。
⑷加入底物，测定底物的颜色反应（颜色深浅程度和速率与待检标本中
的抗体含量有关）。
2.双抗体夹心法——用于
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