SOP时间分辨荧光免疫分析实验操作指南Word格式文档下载.docx

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TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。

从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。

试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。

板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。

TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

3、加样

　　在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。

加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。

　　加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。

加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。

加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！

加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。

加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。

注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！

使用干净的一次性容器配制铕标记物。

铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。

注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；

所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。

注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。

4、孵育

　　在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。

抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。

　　目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。

以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。

这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。

在其后加入的铕标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。

这就是为什么TRFIA反应总是需要一定时间的孵育。

　　孵育在室温进行即可。

室温一般指20-25℃。

室内温度的高低会影响TRFIA的荧光值，升高，抗原抗体反应加速，荧光值提高。

反之，则降低。

全自动仪器，孵育过程在一个恒温（25℃）的孵育器内完成，荧光值比较恒定。

　　如果使用半自动仪器，孵育过程需要加盖封片，防止污染和液体的挥发。

TRFIA房孵育过程一般在振荡器上完成，注意调节振荡的幅度和频率。

振荡的幅度太大、频率太高，微孔板内液体可能溢出，影响实验结果；

振荡的幅度太小、频率太低，抗原抗体反应不完全，也可能影响实验的结果。

振荡器上的微孔反应板不宜叠加堆放。

叠加可能造成反应板的洒落，同时可能造成反应的不均匀。

孵育的温度和时间应严格遵照说明书规定。

不同的检测项目，待测物质的性质不同，反应的时间是有差别的。

5、洗涤

　　洗涤在TRFIA不是一个反应步骤，却也决定着实验的成败。

TRFIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的铕标记物的目的。

通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。

在TRFIA操作中，洗涤是最比较的关键技术，操作者应严格按要求进行。

　　TRFIA的洗涤方式一般使用自动洗板机，不需手工操作。

洗板机在每天使用时应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。

洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后，需将板倒扣在无尘吸水纸上拍干，拍干完毕，将反应板对光检查，孔底内外侧均必须无残留液体。

注意微孔反应板的底部不要弄脏或划伤，不要用手摸微孔反应板的底部。

6、加增强液

TRFIA技术特点之一就是抗原抗体反应完毕，加增强液，使得荧光信号增强100万倍，检测灵敏度大大提高。

　　加增强液时，最好能每次吸取增强液都更换枪头，如果不更换枪头，加增强液时应悬空加入，千万不要让吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成增强液污染。

增强液的体积数应严格按说明书的要求；

加完后增强液不能洒出；

一旦洒出，此次实验无效，需要重做。

第二节时间分辨试剂盒的组成包括：

包被反应板：

一块，96孔。

铕标记抗抗体：

一瓶，冻干品，用时每瓶以1ml去离子水溶解缓冲液

参考标准品：

共六瓶。

增强液：

一瓶，50ml。

浓缩洗液25：

一瓶，50ml，使用前用去离子水作1:

25稀释。

分析缓冲液：

说明书：

一份。

第三节时间分辨操作基本步骤

（1）双抗体夹心法（检测抗原）：

一抗包被、封闭→加入检测样品→加入Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测

例如：

TRFIA法检测甲胎蛋白（AFP）实验方法

1.试剂的准备

1）甲胎蛋白参考标准品：

使用前一小时将每瓶甲胎蛋白参考标准品用1ml去离子水溶解。

2）洗涤液：

将50ml浓缩洗液和1200ml去离子水混合，作为工作洗涤液。

3）铕标抗体工作液：

使用前一小时将每瓶铕标记抗甲胎蛋白抗体用1ml去离子水溶解，用分析缓冲液以1:

75倍稀释作为铕标抗体工作液。

2.将所需数量的包被反应条置室温平衡。

3.每孔加25l甲胎蛋白参考标准品或样品。

a、选一支最接近25l的加样器，因为参考标准品是实验最关键的第一步，所以加样量要求非常准确。

b、在吸参考标准品时枪要在液体内吹打4次，使枪头内的表面张力平衡，从而达到吸样时进一步减少误差。

c、将样品加入到反应孔中要注意枪要垂直轻轻靠在孔壁上打入样品，要保持一个样品一只枪头，这样可以避免加样污染和孔内包被物不受加样影响。

4.加200l分析缓冲液，振动孵育1小时。

a、剪一张与加样条大小相似的封口膜平稳封上加板条，写上标记。

b、将样品板放入震荡器时注意，减速、平稳、轻巧、放入震荡器中。

5.用洗涤液冲洗4次。

a、洗板时要注意板一定要与洗板机的样品架吻合。

6.每孔加铕标抗体工作液200l,振动孵育1小时。

a、铕标是是实验最关键的第二个步骤，所以配铕标时一定要保证，比例准确、充分混匀、加样量准确。

7.用洗涤液冲洗6次。

8.每孔加增强液200l，振荡孵育5分钟。

a、增强液是实验最关键的第三个步骤，虽然增强液是一个不要做任何处理就可以直接使用，但它是一个最形容污染的液体，所以加增强液时一定要注意，加增强液枪头不能碰样品孔、吸增强液手法要轻柔避免液体反压力过大回流到加样器内。

9.测定。

夹心法，浓度与荧光值成正比。

双抗体夹心法标准曲线图1（LOGLOGB拟合方式）

（2）竞争法（检测抗体）：

TRFIA法检测总三碘甲状腺原氨酸（TT3）实验方法

抗原包被、封闭→加入一抗/检测样品→加入Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测

1）总三碘甲状腺原氨酸参考标准品：

使用前一小时将每瓶总三碘甲状腺原氨酸参考标准品用1ml去离子水溶解。

2）洗涤液：

使用前一小时将每瓶铕标记抗总三碘甲状腺原氨酸抗体用1ml去离子水溶解，用分析缓冲液以1:

50倍稀释作为铕标抗体工作液。

3.吸取50μl参考标准品或待测样品，按顺序加入微孔反应条小孔中，然后各加100μl铕标记三碘甲状腺原氨酸工作液和100μl抗三碘甲状腺原氨酸抗体工作液。

a、选一支最接近50l和100l的加样器，因为参考标准品是实验最关键的第一步，所以加样量要求非常准确。

b、在吸参考标准品时枪要在液体内吹打4次，使枪头内的表面张力平衡，从而达到吸样时进一步减少误差。

c、将样品加入到反应孔中要注意枪要垂直轻轻靠在孔壁上打入样品，要保持一个样品一只枪头，这样可以避免加样污染和孔内包被物不受加样影响。

4.室温振动孵育1.5小时。

a、剪一张与加样条大小相似的封口膜平稳封上加板条，写上标记。

b、将样品板放入震荡器时注意，减速、平稳、轻巧、放入震荡器中。

5用洗涤液冲洗6次，拍干。

6.每孔加增强液200μl，振荡孵育5分钟。

a、增强液是实验最关键的第二步，虽然增强液是一个不要做任何处理就可以直接使用，但它是一个最形容污染的液体，所以加增强液时一定要注意，加增强液枪头不能碰样品孔、吸增强液手法要轻柔避免液体反压力过大回流到加样器内。

7.测定。

竞争抑制法，浓度与荧光值成反比。

竞争抑制标准曲线图1（LOGB/Bmax拟合方式）

结果判断时，首先核对不同厂家的试剂盒的标准品浓度和正常参考值范围。

不同厂家因为选择的抗体不同，正常参考值范围会有所不同。

如对实验结果有疑问，应重复实验。

以下为结果判断时的注意事项：

当样本浓度超过了试剂盒的最高检测范围，应该将血样稀释到试剂盒线性范围后重新测定，以保证结果的准确性。

。

当试剂盒的反应模式采用双抗体夹心一步法时，钩状效应的存在会导致以下的结果：

实际浓度很高的血样测值却低，甚至阴性，与临床诊断不符。

此种情况应该稀释血样后重新测定。

试剂盒给出的正常参考值范围为95％的可信限，也就是说95％的正常人群的测值在此范围，还有5％的正常人群测值可能会超出此范围，这一点应该跟临床医生解释。

五、质量控制

建议各医院应建立自己的正常值和质控血清。

每个板条上至少采用两个浓度的质控血清进行质量控制，以确保每次实验测定结果的可靠性。

试验结果如不能同时满足下述两个条件，则此板条的试验结果无效，试验需重新进行：

（1）各质控物的平均值在允许范围内；

（2）重复样本的测定结果相差在10%以内。

第四节时间分辨荧光免疫使用环境要求及注意事项

☐实验中容易产生污染的情况：

✓实验室环境：

这是决定试验成功与否的关键所在。

空气中的灰尘中有很多金属离子及稀土离子，如果灰尘进入板条小孔中，就会引起这个小孔计数有很大偏差。

解决办法：

1）尽量建立一个干净无尘的实验环境。

门窗不要开，尤其是在有风沙的时候。

2）试验桌保持干净。

3）试验用品保持洁净，避免灰尘污染。

如有条件，建议使用超净工作台。

4）在做试验时，加样动作要快，缩短空气污染的机会，加完后立即加盖封片纸。

对于环境欠佳的地方应在加增强液后也加盖封片纸。

✓枪头：

要求枪头干净、没有灰尘，最好要密封保存。

有时客户把枪头放在塑料袋中，用时随时取用，自以为很干净，但塑料袋上有很多破孔（枪头容易戳破袋子），此袋子长期放在露天或不干净的地方，积了不少灰尘，此极易引起污染。

另外，客户在拿取枪头时，尤其是在加增强液时，手指碰到tip头，引起增强液或其他一些试剂的污染。

1）枪头最好放在枪头盒中，并应在不使用时关闭枪头盒。

2）手指避免触碰tip头，尤其是在加增强液时。

3）尽量使用质量较好的枪头，如果没有条件，可以在吸取增强液时把第1~2枪增强液打掉（用增强液洗枪头），这是一个好办法。

✓水：

配置浓缩洗液的水要求去离子水，纯度不高的水质对荧光会产生淬灭作用。

✓吸水纸：

在洗板之后要拍板，建议使用无尘吸水纸，如果纸质差，会有纸屑掉入小孔中，引起荧光计数值有偏差。

✓加样手势：

要求加样时枪头悬空，不要使枪头碰到小孔边缘，更不能使枪头碰到小孔中的试剂，这在加增强液和中和抗原时尤为重要。

✓加样时注意不要在枪头及试剂瓶口产生气泡，如果气泡破裂，容易引起其他试剂或者小孔的污染。

✓洗板过程：

注意洗板机洗板时注水高度，一定要在小孔上缘形成拱起的液面，如注水量达不到要求高度，会引起洗板不彻底，荧光计数值会有偏差。

另外，应注意洗板机吸水是否彻底，残留量应极少。

解决方法：

调节洗板机液面高度，调节吸水量，如有吸水针头堵塞，可用通针通。

如有困难，可求助于维修工程师。

✓消耗品：

要求使用干净的一次性塑料容器来配置试剂，尤其是配置铕标记物时，配置好的铕标记物应在一个小时之内使用，用剩下的应废弃。

避免铕标记稀释液进入铕标记物中。

☐实验成功条件：

✓全面系统地了解时间分辨荧光技术，了解铕的特性，才能主动避免污染。

✓严格按照说明书操作。

✓严格遵守以上几个注意点。

1.在实验室条件允许的前提下，尽量使用精确度高的加样枪及其他加样设备。

尤其临床标本量大时，使用8~12通道排枪是最佳选择，可以加快加样速度，提高实验的准确性。

2.加标准品时，应从浓度低~高，可以不换枪头，但每加一个浓度，应把枪头在这个瓶中反复吸打几下，以避免导致复孔平行性差。

3.试剂均应混匀后再加入，配置铕标记物后应充分混匀，以保证取得好的CV。

4.揭掉封片纸时应小心，不要洒落其中试剂。

5.当实验结果不理想、病人血样结果在临床上无法解释或对此次实验结果有疑问时，应重复实验。

在客户已经充分掌握时间分辨荧光这个方法且能熟练操作实验、所做实验结果稳定之后，再考虑用两点定标法来做，或同一批号用同一条曲线。

中心技术支持部

时间分辨组