毕业设计 大豆F2 5群体主茎节数的QTL定位Word格式文档下载.docx
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1.2.6PCR扩增产物的电泳检测5
1.2.7硝酸银渗透及显色6
1.2.8数据记录与统计分析6
1.2.9重要性状的调查7
1.2.10连锁群构建7
2结果分析8
2.1：
大豆主茎节数试验数据8
2.2大豆主茎节数QTL定位13
小结15
参考文献16
致谢17
MappingQTLofnodesinmainstem
insoybean
（GlycinemaxL.Merrill）
姓名
专业
指导教师
引言
大豆[Glycinemax（L.）Merr.]，原产于中国，为豆科大豆属一年生草本植物。
大豆作为重要的粮食作物,为人类提供主要的植物蛋白和油分。
大豆蛋白质在豆科作物中的蛋白质含量最高,并含有较多的必需氨基酸,尤其是赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸的含量分别是玉米的9.25和6倍（庄炳昌，2002）。
人们对食品级大豆的需求在国内外市场上逐渐上升（M.S.S.Rao,B.G.Mullinix,M.Rangappaetal.2002,94）。
同时也是饲料蛋白的重要来源（CLARKEEJ，WISEMANJ，2000；
FRIEDMANM，BRANDONDL.，2001）。
因此,大豆品质性状的遗传改良,已被国内外大豆育种工作者列入主要的研究目标。
影响大豆产量的农艺性状有很多，而主茎节数是其中之一（主茎节数是指从子叶算起至主茎顶端的实际节数），本实验主要是通过QTL定位，研究并寻找影响主茎节数的主因素，从而为提高产量奠定基础。
QTL（QuantitativeTraitLoci）即数量性状基因座位,是控制数量性状的基因在基因组中的位置。
QTL定位（QTLMapping）是检测分子标记和QTL间的连锁关系,估计QTL的效应利用分子标记进行遗传连锁分析,检测出QTL。
因为对育种直接有益,农艺性状如大豆产量的QTL研究的较多（MansurLM,OrfJH,ChaseK,JarvikT,CreganPB,LarkKG，1327-1336；
OrfJH,ChaseK,JarvikT,MansurLM,CreganPB,AdlerFR,LarkKG，1642-1651等）。
自1900年keim开始对大豆农艺性状进行QTL分析以来，已经在大豆连锁图谱定位大量关于大豆产量性状的QTL，而主茎节数就是其中一个重要的农艺性状；
随后许多学者利用已构建的大豆遗传图谱对大豆重要农艺性状进行了QTL定位分析（Lark，1993；
Mansur，1993；
Mian，1996；
Lee，1996；
Mian，1998；
Brummer，1997；
Hyten，2004）。
到目前为止，已有1174个大豆QTL定位结果储存于大豆数据库网站Soybase，其中包括与产量性状有关的单株荚数、每荚粒数、百粒重、豆芽产量等；
与品质性状有关的蛋白质含量、脂肪含量、亚麻酸含量、油酸含量、亚油酸含量等；
与抗病虫性有关的如抗孢囊线虫病、大豆瘁死综合症、大豆根结线虫病、菌核病、芽枯病、茎褐腐病、花生根结线虫病、疫霉根腐病及玉米螟等；
与抗逆性有关的如耐铝胁迫、耐旱性、耐渍性、倒伏性等；
以及生育期、株高、开花期、光周期敏感性、铁素营养、叶面积、豆荚开裂等56个农艺性状。
定位所用标记以SSR、RFLP居多。
本研究利用来自溧水中子黄豆×
南农493-1的282个F2:
5家系，在已完成150对SSR分子标记基础上，首先利用F2群体构建分子标记的大豆遗传图谱；
然后，利用该连锁图，用WindowsQTLCartographerV2.5软件包中的复合区间作图法（CompositeintervalmappingCIM）和多区间作图法（MultipleintervalmappingMIM）方法，定位了大豆主茎节数有关性状的QTL定位，并分析其与大豆遗传的关系。
通过QTL定位让我们更好的了解大豆的生长和遗传特性，认识品种间的亲缘关系，在大豆引种和遗传改良种起到很关键的作用。
从而也为提高大豆产量奠定了良好的基础。
1 实验材料及方法
1.1实验材料
1.1.1品种简介
溧水中子黄豆：
江苏省地方品种，对大豆花叶病毒（SMV）具有抗扩展特性。
特征：
具有一定的野生性状，株高较高，一般70cm左右，主茎有蔓生现象，主茎17.90节，分枝9.13个，结荚高度23cm左右。
黄种皮，有色泽，不爆裂，黄子叶，子粒椭圆型。
子粒较小，百粒重12-13g。
特性：
属南方夏大豆晚熟品种类型。
全生育期130天。
6月中旬播种，每亩密度1.5-2.0万株，8月中旬开花，10月中旬成熟，对大豆花叶病毒具有抗扩展特性。
对豆卷叶螟有较强抗性。
蛋白质含量44.25%，脂肪含量18.42%。
适应性广，配合力好。
南农493-1：
原南京农学院于1956年利用前中央农业实验所的51-83大豆材料经选择单株系统选育而成。
1959年参加江苏省区域试验，区试后，1962年确定为江苏省淮南地区大豆推广品种。
高感大豆花叶病毒（SMV）。
豆荚螟较重，蛋白质含量46.54%，油份含量16.36%，一般亩产100-150公斤，高产田块超过200公斤，适于长江中下游地区作夏大豆种植，推广450万亩。
到目前为止，以其为亲本至少育成22个以上大豆新品种。
1997年，“大豆优良亲本南农493-1的育种利用价值”获得农业部科技进步三等奖。
有限结荚习性，株高中等，一般50cm左右，株型紧凑，收敛，主茎14.35节，分枝4.46个，结荚高度18cm左右。
种脐淡褐色，子粒较大，百粒重18-20g。
荚型呈弯镰形，荚灰黄色，二粒型，不裂荚。
白花，灰毛，叶型中等大小，椭圆形，叶色浓绿，成熟时落叶。
全生育期136天。
6月上旬播种，8月中旬开花，10月中旬成熟，每亩密度1.5-2.0万株，耐肥抗倒，不耐旱，但耐阴性强。
1.2实验方法
田间种植：
一个品种种植三行分别插标签。
田间大豆间苗：
约15cm株距。
取叶片：
取倒三叶的中间叶，每个品种取叶片5片装自封袋包好带回实验室。
植株成熟时，每个家系取中间行从第二株开始的连续5株，测量植株主茎节数，取平均值。
DNA的提取采用CTAB法，PCR仪扩增,电泳试验，读胶。
1.2.1试剂配制
1.CTAB提取缓冲液配方（10ml）
CTAB
0.2g
EDTA（0.5MPH8.0）
1ml
Nacl
0.82g
H2O
7.44ml
ß
－巯基乙醇
560μl
PVP
0.05g
Tris一Hcl（1M,PH8.0）
2.0.5MEDTA（PH8.0）的配制（100ml）
EDTA
18.61g
NaOH
2g
加纯水搅拌溶解，定容至100ml，PH调至8.0。
灭菌，室温放置备用。
1.2.2DNA提取方法
恒温水箱使用上海康华生化仪器制造厂HS-3001型。
低温离心机使用sigma型号:
1-15K。
1、取新鲜叶片在液氮中磨成粉末状，用1.5ml离心管取0.2g研磨好的叶片组织，加入65℃预热过的CTAB提取液650μl。
2、65℃水浴50min，每隔十分钟摇动均匀。
3、加入等体积的酚/氯仿（24:
1）充分混匀，静置10min，5000rpm离心20min。
4、取上清液至另一离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:
1），混匀，静置10min，5000rpm离心10min。
5、取上清液至另一离心管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，混匀，4℃静置1小时，5000rpm离心10min。
6、倒掉上清液，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，在灭菌台吹干，向离心管中加入200-300μl无菌水溶解DNA，溶解后将离心管放入4℃冰箱保存备用。
7、用酶标仪检测DNA的浓度，稀释到工作液浓度20ng/μl，用于PCR扩增。
1.2.3SSR分子标记
本实验所选择的SSR引物参照Cregan（2003）的“大豆公共图谱”。
SSR引物的序列在大豆数据库Soybase（http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov）中获得，由上海生物工程公司合成150对引物。
1.2.4PCR的扩增及检测
PCR仪使用德国Eppendorf
PCR反应总体积为15μl，PCR反应体系含10×
PCRBuffer（含15mMMg2+）1.5μl，dNTP（10mM）0.2μl，Tag酶（5μ/μl）0.15μl，引物3μl，ddH2O5.15μl，模板DNA（20ng/μl）5μl。
PCR反应程序为95℃预变性2min；
94℃变性30sec，47-55℃退火45sec，72℃延伸1min，运行35个循环；
最后72℃延伸10min，4℃保存。
用8%非变性聚丙烯酰胺胶对扩增产物进行分离，银染检测。
1.2.5电泳凝胶制备
1、玻璃板清洗干净，彻底干燥后进行板的组装，并用1%的琼脂糖封胶。
2、电泳凝胶的配置：
（30%丙烯酞胺溶液）
所需试剂：
丙烯酰胺 29g
N,N,-亚甲基双丙烯酰胺 1g
溶于纯水中，加热至37℃溶解，最终定容至100ml。
置于棕色瓶中，4℃保存。
使用时稀释至8%。
3、5×
TBE配制
Tris
54g
硼酸
27.5g
0.5M/lEDTA（PH8.0）
20ml
加纯水定容至1000ml。
4、灌胶：
把40ml8%丙烯酰胺胶（一个电泳槽的用量）倒入三角烧瓶中，加入450μl10%的AP（过硫酸铵）、25μlTEMED，混匀，排出气泡后，静置30秒，缓慢倒入玻璃板间，待胶流动到底部边缘，插入梳子，梳齿朝外，静置聚合30分钟。
1.2.6PCR扩增产物的电泳检测
电泳仪：
使用北京六一仪器厂的DYY-6C型。
电泳槽:
使用北京六一仪器厂的DYCZ-30型。
1、电极缓冲液：
为1×
TBE；
2、预电泳：
拔出梳子，立即用蒸馏水冲洗点样口，刮去附着在点样口上多余的胶，预电泳20分钟；
3、上样：
预电泳后，使用微量进样器点入DNA扩增产物3μl，其中加入6×
Loadingbuffer（15%聚蔗糖（Ficoll400型），0.03%溴酚蓝，0.03%二甲苯氰，0.4%OrangeG，10mMTris-HCI（PH=7.5），50mMEDTA）2μl，200V恒压电泳，时间可视SSR扩增产物的分子量大小而略加调整。
1.2.7硝酸银渗透及显色
步骤如下：
1、固定：
电泳结束后，将凝胶放入固定液中，轻摇20-30分钟，至指示剂无色；
固定液的配制：
200ml
10%冰醋酸
10ml
乙醇
20ml
纯水
170ml
2、渗透：
放入渗透液中，轻摇12分钟；
渗透液的配制：
400ml
AgNO3
0.8g
3、使用纯水清洗两次，每次30秒。
4、显色：
放入显色液至DNA条带显出。
显色液的配制：
500ml
8g
甲醛
5.4ml
5、使用纯水清洗三次，用保鲜膜包好，使用Quantityone读胶仪扫胶。
1.2.8数据记录与统计分析
对于共显性的SSR标记，根据其特点及扩增的电泳结果，将与亲本溧水种子黄豆带型相同的记为1，与亲本南农493-1的带型相同的记为2，杂合的带型记为0，缺失和不清晰的带型记为“-”。
1.2.9重要性状的调查
本杂交组合于2005年在南京农业大学江浦实验基地配制而成，同时配制正反交组合，并在海南进行南繁获得F2种子。
F2种子于2006年6月在南京农业大学江浦实验基地种植获得F2植株群体，小区行长3m，株距10cm，共得到正交F2单株244株，反交F2单株300株。
采用系谱法繁殖后代，F2群体单株收获种子，衍生F2:
3家系，于2007年6月在南京农业大学江浦实验基地种植，随机区组设计，每个家系分三行种植，小区行长1.5米，株距10cm，成熟时中间一行单独收获考种，旁边两行作为保护行收在一起。
2009年在山东临沂采用同样的方法进行了F2:
5的种植。
重要性状的调查标准参照《中国大豆品种志》中的大豆性状分级标准，并参考了相关研究文献，对F2:
5家系进行田间调查和室内考种。
1.2.10连锁群构建
利用Joinmap3.0作图软件，采用Group命令，以LOD值大于2.0进行人工分组，每一个Group可以采用不同的LOD值标准，然后选择Calculatemap命令，应用Kosambi作图函数进行重组率与遗传距离（Morgan）间转换，构建分子标记连锁图谱。
2结果分析
大豆主茎节数试验数据
表1家系主茎节数
家系
平均数
ZF001
24
19
23
22
25
22.6
ZF002
21
20
20.8
ZF003
18
ZF004
17
21.2
ZF006
22.8
ZF007
21.4
ZF008
16
20.4
ZF009
22.4
ZF010
22.2
ZF011
ZF012
19.2
ZF013
18.2
ZF014
ZF015
19.4
ZF016
ZF017
ZF018
20.6
ZF019
23.2
ZF020
23.4
ZF021
ZF022
20.2
ZF023
19.8
ZF024
21.8
ZF025
ZF026
ZF027
15
18.4
ZF028
ZF029
ZF030
27
ZF031
ZF032
19.6
ZF033
ZF034
ZF035
ZF038
ZF039
26
ZF040
ZF041
ZF042
ZF043
ZF044
23.8
ZF045
24.8
ZF046
ZF047
ZF048
24.4
ZF049
ZF050
ZF051
ZF052
ZF053
ZF054
ZF055
ZF056
ZF057
ZF058
ZF059
ZF061
ZF062
ZF063
ZF064
28
ZF065
ZF066
ZF067
ZF068
ZF069
ZF070
ZF071
ZF072
ZF073
ZF074
ZF075
ZF076
23.6
ZF077
21.6
ZF081
ZF082
ZF083
ZF084
ZF085
ZF086
ZF087
ZF088
ZF089
25.2
ZF100
ZF101
ZF102
14
ZF103
ZF104
ZF105
ZF106
ZF107
ZF108
ZF109
13
ZF110
ZF111
ZF112
ZF113
ZF114
ZF115
29
ZF116
ZF117
ZF118
ZF119
ZF120
ZF121
ZF122
ZF123
ZF124
ZF125
ZF127
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