免疫组化试题有答案Word格式文档下载.docx
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6.质量控制:
指组织化学反应各环节中获得最佳效量及其代谢状态的学科。
其目的是联系形态、化学
果的技术把握,是组织化学的关键环节,是取得满万分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。
意效果的必要条件,是提高结果可信度的根本保11.ABC法:
即亲和素-生物素-过氧化物酶复合物
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法,其基本原理是在抗生物素和生物素之间形成共适的第二抗体。
价和不可逆的结合,通过抗生物素在辣根过氧化物12.细胞骨架:
指细胞内的结构网架,由一些细丝
酶和第二抗体之间建立生物素桥联,使酶定位于所成分组成,包括微丝、微管、中间丝和微梁网格。
需测定的特异性抗体周围。
其优点在于易于找到合
二、问答题
1.简述酶组织化学的基本原理。
⑶杂交后处理①冲洗:
用一系列浓度不同的和温度
答:
在酶组织细胞化学方法中,从原理上讲,可分不等的平衡盐液冲洗(一般原则是盐液的浓度由高
为两在类型。
一类是酶是活性——酶组织细胞化学到低,温度由低到高),并在冲洗的过程中防止切
方法,属于一般组织细胞化学方法。
一类是酶蛋白片干燥;
②RNA酶消化处理:
仅使用于RNA杂交。
质的存在及存在的部位——免疫酶组织细胞化学⑷显示/杂交体的检测:
①同位素标记者:
用放射
方法,属于免疫组织细胞化学的内容。
目前,通常自显影技术显示。
②非同位素标记者:
应选择相应
是将两者结合起来,即显示酶活性,又酶蛋白的存的方式显示。
⑸对照实验:
根据核酸探针和靶核苷
在、分布及代谢情况。
酸的种类在现有可能条件下选定。
2.用箭头表示免疫电镜技术(包埋前法)的过程。
4.组织化学质量控制有哪些方法?
包埋前法实用于酶标法和PAP法。
具体过程答:
组织化学质量控制的方法有:
⑴实验过程的质
如下:
取材→→固定→→冰冻切片(40~150μm)量控制:
①试剂的质量控制,包括:
试剂的特异性
→→免疫染色(同酶标法和PAP法)→→选择和敏感性;
最佳的稀释度;
在已知阳性和阴性的标
阳性部位,在解剖显微镜下,取下阳性部位,裱于本上,观察其染色结果的复合情况;
要确定染色的
盖玻片上→→1%的锇酸固定,1~1.5h→→脱水温度和时间;
保存的时间和有效期的时间。
②操作
→→平板包埋聚合→→修块、超薄切片步骤的质量控制,包括:
组织标本制备的质量控制;
(50~80nm)、裱于铜网→→重金属盐双重染色→操作过程各环节的质量控制a.各种溶液的浓度、
→电镜观察、记录、照片。
成分、PH值的控制,容器的质量标准。
b.特殊试
3.简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。
剂的配制:
c.步骤中间环节的控制;
⑵背景染色
此过程包括:
⑴杂交前准备:
取材和固定→玻的控制①疏水作用②离子作用—电荷作用③内原
片及盖片的处理(粘附剂的使用)→器皿处理和溶性酶活性作用④抗体污染或/抗体纯度不高⑤内原
液配制容器的处理→增加组织的通透性和核酸探性抗生物素/生物素蛋白结合活性⑥抗原的扩散⑦
针的穿透性→减低背景染色→防止RNA酶的污交差反应⑧其它原因。
染;
⑵杂交过程(杂交反应):
包括变性与杂交;
5.比较PAP法和ABC法的异同。
PAPABC
灵敏性低(1倍)高(20倍)
特异性高更高
背景一般有背景一般很少或无背景
复合物特点
PAP复合物
只用于PAP法,且抗体与一抗的种族相同
ABC复合物
用途广,可通用,用生物素标记的均可
用途免疫组织化学(IHC)IHC、ELISA、原位杂交
6.简述PAP法的过程。
的多聚甲醛4-5h(4℃)固定后直接进行冰冻切片。
⑴处理切片,封闭内源性物质和避免交叉反应;
9.简述结果的判断的类型及意义。
⑵抗孵育切片,湿室,37℃,30-60分钟;
⑶PBS答:
结果的判断类型:
⑴定性判断,即实验结果真
漂洗,3次,5分钟/次;
⑷2抗孵育切片,湿室,实性判断;
⑵定位判断,即结果出现的部位的确定,
室温,37℃,30-60分钟;
⑸PBS漂洗,3次,5可以协助定性判断;
⑶定量判断是结果判断中最重
分钟/次;
⑹加入PAP复合物,孵育30分钟;
⑺要也最具有意义的判断。
意义:
实验结果的判断直
PBS漂洗,3次,5分钟/次;
⑻染色0.01~接关系着实验的成败,因此,结果判断是整个实验
0.02%H2O2+0.01~0.05%DAB+0.05~
工作的核心和结论,必须是真实的结果,特别是一
0.10UMTris-Hcl(PH7.40)室温,3-5分钟,避光;
些实验结果与前人或与其它文献报道差异较大时,
⑼漂洗,双蒸馏水洗涤;
⑽复染;
⑾漂洗,双蒸馏作出结果判断时应特别慎重。
水洗涤;
⑿脱水、透明、封片;
⒀光镜观察,记录。
10.简述核酸原位杂交技术的特点。
7.定量分析有哪些方法?
答:
核酸原位杂交技术的特点如下:
①特异性与敏
⑴人工定量分析;
⑵仪器定量分析:
①显微荧感性高。
②在组织细胞内定位可检测的靶序列。
③
光分光光度计;
②显微分光光度计/仪;
③显微图能够将组织学表现与基因功能的变化相结合。
④可
像分析仪:
灰度、长度、周边、面积、曲线长等;
完好的保存组织与细胞的形态结构。
⑤不需要从组
④流式细胞计数仪;
⑤激光扫描共聚焦显微镜技织细胞中提取核酸,避免了抽提中核酸量的损失。
术。
⑥对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性,
8.增强组织化学染色的方法有哪些?
可在1%细胞中检出目的核酸序列。
⑦可用于研究
⑴酶消化在抗原暴露中的作用:
①胃蛋白酶:
个别细胞中的核酸,而不受组织中其他细胞的影
0.4%、37℃、20~30分钟。
②胰蛋白酶:
0.1%、37响。
⑧不需要破裂细胞,经适当处理后探针可进入
℃、5~40分钟。
③链霉蛋白酶:
0.06%、室温、细胞,与细胞内核酸杂交。
10分钟。
⑵微波炉处理在暴露抗原中的作用:
其11.用箭头表示石蜡切片技术的步骤。
原理在于通过微波管发射较高频率的电磁波而使答:
石蜡切片技术步骤:
①取材→②固定→③脱水
组织内部的分子发生高速振荡,使组织温度升高,→④透明→⑤浸蜡→⑥包埋→⑦切片。
同时加速分子交联,促使组织中抗原决定簇暴露。
12.简述免疫组织细胞化学技术的全过程。
步骤:
脱蜡、水化的标本微波处理10~20分钟,答:
免疫组织细胞化学技术全过程:
抗原提取和纯
功率600W→室温冷却15分钟以上→常规免疫细胞化→→免疫动物→→抗体的分离、提取、纯化和
化学染色。
⑶不同抗原组织准备方法的检测:
主要效价的确定→→标记抗体→→标本制备→→免
在固定方法和固定剂上存在差异。
①细胞外和基底疫反应过程→→观察及结果判断与分析。
膜相关蛋白抗原:
交联固定剂碳二亚胺和蛋白沉淀13.常见的免疫组织化学方法有哪些?
类固定剂乙醇。
②细胞膜和胞浆相关免疫球蛋白:
常见的免疫组织化学方法:
①免疫荧光组织/
首选蛋白沉淀类固定剂乙醇。
③胞浆酶和胞浆激细胞化学技术;
②免疫酶标组织/细胞化学技术;
素:
醛类固定剂。
④各类组织和细胞抗原:
低浓度③过氧化物酶一抗过氧化物酶法(PAP法);
④抗
生物素—生物素复合技术(ABC法);
⑤SPA免疫性和复性的原理,用已知碱基序列的单链核酸片段
组织/细胞化学技术;
⑥免疫电镜技术。
作为探针检测样品中是否存在与其互补的同源核
14.影响核酸杂交的因素有哪些?
酸序列的方法。
即双链核酸分子(DNA双链)分
影响核酸杂交的因素:
①核酸分子的浓度和长子分解为单链—变性(采用加热/提PH值来实现)
度:
核酸浓度大,单链核酸间的碰撞几率大,复性→→杂交后单链聚合为双链—退火/复性。
几率大。
单链探针浓度越大,杂交效率高,但双链16.简述组织化学的基本要求。
探针浓度过高会影响杂交的效率。
②温度:
温度过答:
组织化学的基本要求:
①保持组织细胞良好的
高不利于核酸的复性,温度过低不利于少数碱基配形态结构。
②具备高度的特异性。
③应有一定的灵
对形成的局部双链分离。
③离子强度:
离子强度低,敏性。
④可重复性。
⑤生物反映的产物必须在原位
杂交速度慢,随着离子强度增高杂交反应率增加。
沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。
④杂交液中的甲酰胺:
甲酰胺是一种变性剂,能干17.简述免疫组化在人体研究中的主要用途。
扰碱基堆积力和氢键的形成,因此可减低核酸杂交答:
免疫组化在人体研究中的主要用途:
㈠免疫组
的Tm。
⑤核酸分子的复杂性:
核酸的复杂性是指化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用:
(1)
存在于反应体系中不同顺序的总长度,复杂性越组织起源不明肿瘤的研究;
(2)研究病原体与肿瘤
高,形成正确配对难度越大,反应速度越慢。
⑥非的关系;
(3)协助确定肿瘤的良恶性;
(4)测定肿
特异性杂交反应:
为减少非特异性杂交反应,在杂瘤细胞的增殖活性;
(5)分化差的癌和肉瘤的鉴别;
交前将非特异性杂交位点进行封闭,以减少对探针(6)确定转移性恶性肿瘤的原发灶;
(7)恶性淋
的非特异性吸附作用。
巴瘤的诊断和分型;
(8)为制定肿瘤的治疗方案提
15.简述核酸分子原位杂交的基本原理。
供依据。
㈡免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的
核酸分子杂交是依据DNA双链碱基互补、变应用;
㈢免疫性皮肤疾病在诊断中的应用。
三、填空题
1.影响酶催化反应的因素是酶浓度、底物浓度、物素—HRP、金属。
激活剂浓度、抑制剂浓度、PH值、温度。
7.根据探针的核酸性质分基因组DNA探针,cDNA
2.核酸杂交的一般步骤是待测核酸的制备与变性探针,RNA探针,寡核苷酸探针四类。
→探针的制备及标记→固相支持物的选择与处理8.仪器定量分析技术有显微荧光分光光度计、显微
→预杂交、杂交、漂洗→检测显示杂交信号→结果分光光度计/仪、显微图像分析仪、流式细胞计数
的判断分析。
仪、激光扫描共聚焦显微镜技术。
3.增强特异免疫染色的方法有①蛋白酶消化法②9.组织化学的基本要求是保持组织细胞良好的形
合适的抗体稀释液③温育的时间长短30~60℃4态结构,具备高度的特异性,应有一定的灵敏性,
℃过夜④多层染色,提高敏感度。
可重复性,生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、
4.常用的固定剂是醛类、非醛类、金属类。
不溶和具有稳定性的特点。
5.核糖体是核糖核酸和蛋白质组成。
10.石蜡切片的5大步骤是①取材→②固定→③脱
6.抗体常用的标记物有荧光素、酶、抗生物素—生水→④浸蜡、包埋→⑤切片。
11.组化中常用的酶类:
辣根过氧化物酶(HRP)、22.实验过程的质量控制是试剂的质量控制、操作
小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、葡萄糖氧化酶、β-步骤的质量控制、背景染色的控制。
半乳糖苷酶。
23.在酶组织化学中,根据其反应原则,显示酶的
12.固定基本原则是组织块要尽量小,固定要及时方法,可分为沉淀反应法和电子传递法两大
和适时,选择合适的固定剂,要注意固定剂的浓度、类。
PH值和温度。
24.辣根过氧化物酶(HRP)显色原有DAB、AEC、
13.固定方法是浸入法和灌注法。
CN、H-Y试剂。
14.免疫组织/细胞化学特点是高度特异性,高度敏25.荧光组织化学分为自发荧光、诱发荧光、荧光
感性,方法和过程统一,形态、机能、新陈代谢等染色、免疫荧光、酶促荧光。
生命活动相结合。
26.荧光图象的记录方法有描述法、荧光照相、暴
15.核酸原位杂交技术的特点是光时间测定法、强弱表示法、显微荧光测定法。
特异性、敏感性高;
可检测的靶序列在组织细胞内27.免疫反应的形成可分致敏阶段、反应阶段和
定位;
能够将组织学表现与基因功能的变化相结效应阶段三个阶段。
合;
可完好的保存组织、细胞的形态结构;
不需要28.PAP法的特点是抗体活性高;
灵敏度高;
背景
从组织细胞中提取核酸,避免了抽提中核酸量的损染色浅,有利于观察和记录。
失;
对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感29.ABC法的优点是①敏感性强;
②特异性强,背
性,可在1%细胞中检出目的核酸序列;
可用于研景染色浅;
③方法简单,节约时间;
④ABC试剂
究个别细胞中的核酸,而不受组织中其它细胞的影盒国内已大量生产,价格适中;
⑤生物素具有与多
响;
不需破裂细胞,经适当处理后探针可进入细胞,种显示剂结合的能力,可用作双重或多重免疫染
与细胞内核酸杂交。
色。
16.内质网分粗面内质网和滑面内质网两类。
30.免疫电镜技术的基本要求是保持超微结构完
17.根据试剂或标记物的不同分一般组织化学、荧好,结构不改变;
保存最多的抗原及抗原活性。
光组织化学、免疫组织化学、核酸分子原位杂交组31.免疫电镜技术分铁蛋白标记免疫电镜技术、酶
织化学四类。
标记免疫电镜技术、PAP法和胶体金免疫电镜技
18.核糖体分游离核糖体、附着核糖体、多聚核糖术四类。
体三类。
32.胶体金免疫电镜技术优点是①金颗粒电子密度
19.溶酶体分初级溶酶体、次级溶酶体、残余体三高,清晰可辩,形态规则;
②方法简单一些,不如
类。
PAP法复杂;
③同一组实验,可用不同直径的金颗
20.细胞骨架是微丝、微管、中间丝和微梁网架粒可作多种抗原的区别研究,双标;
④金标抗体能
组成。
发生二次电子,可作用扫描电镜观察。
21.确定最适PH的方法是查阅文献,根据前人的经33.免疫电镜技术包埋后法缺点是①抗原及活性损
验,预实验印证和实验测定最适PH值。
失大;
②部位不准;
③得到阳性结果难度大。
四、实验设计题
(一)某实验室拟采用ABC法研究缺血性心肌损
(二)某实验室拟采用PAP法研究缺血性脑损伤
伤时ANP(ANF)的变化。
请设计此课题。
时NPY的变化。
1、准备哪些试剂和药品。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯;
30%H2O2和浓盐酸;
ABC免疫复合物试二甲苯;
PAP免疫复合物试
剂;
抗大鼠ANP的特异性兔抗体(一抗);
生物素剂(来自于兔);
抗大鼠NPY的特异性兔抗体(一
标记羊抗兔免疫球蛋白(二抗);
正常羊血清PBS抗);
猪抗兔免疫球蛋白(二抗);
正常猪血清PBS
液;
DAB显色剂;
梯度酒精溶液(100%、95%、液;
梯度酒精溶液(100%、95%、
90%、80%、70%);
蒸馏水;
磷酸盐缓冲液PBS;
90%、80%、70%);
复染液(如苏木精);
封片剂(中性树胶)等。
复染液(如苏木精);
2、写出实验的思路或过程。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组:
取大鼠(同种、同窝别、相近⑴实验动物与分组:
取大鼠(同种、同窝别、相近
体重)20只,随机分为2组,实验组(缺血组)体重)20只,随机分为2组,实验组(缺血组)
10只,对照组10只。
10只,对照组10只。
⑵实验组大鼠采用结扎冠状动脉方法制作缺血性⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全
心肌损伤模型,对照组(即假手术组)只暴露冠状脑缺血性动物模型,对照组(即假手术组)只暴露
动脉但不结扎。
颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程:
①从实验组大鼠心肌损伤组织中按设⑶实验过程:
①从实验组大鼠大脑皮质组织中按设
计好的不同时间点取材(对照组取材部位、时间与计好的不同时间点取材(对照组取材部位、时间与
实验组相同),制备石蜡切片标本;
②石蜡切片脱实验组相同),制备石蜡切片标本;
②石蜡切片脱
蜡下水;
③3%H2O2室温避光封闭20min,蒸馏水蜡下水;
③3%H2O2室温避光封闭20min,蒸馏水
洗;
④TBS微波修复抗原,0.01mLMPBS洗3min洗;
④TBS微波修复抗原,0.01mLMPBS洗3min
×
3次;
⑤正常羊血清37℃,孵育20min,甩干不×
⑤正常猪血清37℃,孵育20min,甩干不
⑥兔抗ANP37℃孵育1h,0.01MPBS洗3min洗;
⑥兔抗NPY37℃孵育1h,0.01MPBS洗3min
⑦生物素化羊抗兔IgG37℃孵育30min,×
⑦猪抗兔IgG37℃孵育30min,0.01MPBS
0.01MPBS洗3min×
⑧加ABC复合物37℃洗3min×
⑧加PAP复合物37℃孵育30min,
孵育30min,0.01MPBS洗4min×
4次;
⑨DAB室0.01MPBS洗4min×
⑨DAB室温避光显色
温避光显色5~10min(镜下控制显色时间),自来5~10min(镜下控制显色时间),自来水终止;
○10
水终止;
○10切片脱水,透明封片。
切片脱水,透明封片。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑸观察记录结果:
出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑸观察记录结果:
⑹将实验组与对照组比较,用统计学方法分析,得⑹将实验组与对照组比较,用统计学方法分析,得
出结论。
出结论。
(三)某实验室拟采用核酸原位杂交技术研究缺血⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑸观察
性脑损伤时SPmRNA的变化。
记录结果:
⑹将实验组与对照组比较,用统计学方法分析,得
梯度酒精溶液
(100%、95%、90%、80%、70%);
复(四)某实验室拟采用免疫电镜技术(包埋前法)
染液(如苏木精);
封片剂(中性树胶);
0.1MPBS研究缺血性脑损伤时NPY的变化。
(pH7.2);
0.2MPB((pH7.2);
0.1M甘氨酸;
4%多1、准备哪些试剂和药品。
聚甲醛;
16×
Denhardt溶液;
预杂交液;
20×
SSC;
二甲苯;
抗体稀释液;
TSM1;
DIGDNA标记检测试剂盒。
(100%、95%、90%、80%、70%);
0.01M
PBS缓冲液;
封片剂(中性
取大鼠(同种、同窝别、相近树胶);
0.5%戊二醛-2%多聚甲醛;
30%蔗糖/PBS
体重)20只,随机分为2组,实验组(缺血组)溶液;
1%牛血清;
⑵实验组大鼠采用结扎双侧抗);
生物素标记羊抗兔免疫球蛋白(二抗)。
颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型,对照组2、写出实验的思路或过程。
(即假手术组)只暴露颈总动脉但不结扎。
⑴实验动物与分组:
①麻醉大鼠后,用4%多聚甲醛灌流体重)20只,随机分为2组,实验组(缺血组)
固定后取材,制备冰冻切片。
②随机引物制备10只,对照组10只。
⑵实验组大鼠采用结扎双侧
cDNA核酸探针,并用DIGDNA标记检测试剂盒颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型,对照组
检测探针敏感性。
③预杂交:
滴加适量预杂交液,(即假手术组)只暴露颈总动脉但不结扎。
42℃30min。
④杂交:
倾去预杂交液,在每张切⑶实验过程:
①麻醉大鼠后,经主动脉灌流0.5%
片上滴加10-20μl杂交液(将探针变性后稀释在戊二醛-2%多聚甲醛固定后取材,制成厚切片。
②
预杂交液中,0.5ng/μl),覆以盖玻片或蜡膜,PBS漂洗3次,每次15min。
③30%蔗糖/PBS溶液
42℃过夜。
(注意阴性对照)⑤洗片:
4×
SSC、2中室温下静置至沉底。
④液氮冻融,增加细胞膜通
SSC、1×
SSC、0.5×
SSC37℃各洗20min;
0.2透性。
⑤1%牛血清孵育组织块30min后PBS漂洗
SSC37℃洗10min;
0.2×
SSC与0.1MPBS