从患者开始谈基因检测的整个流程Word下载.docx
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2，实验室部分；
3，信息分析部分；
4，临床解读部分。
五脏俱全的基因检测公司应该包含以上所有的四个程序，除非存在部分业务外包的情况，例如有的公司只做临床解读部分。
1）检测前咨询部分：
不是所有的癌症患者都应该检测，都值得检测，检测目的是为了明确是否可以使用靶向药物，还是仅仅为了玩，选择哪种产品更加适合，这些都是需要在这部分搞清楚。
2）实验部分：
应该取多少组织样本，测序过程中有哪些细节步骤，这可是个核心环节。
3）信息分析：
实验部分做完以后所得到的是一大堆序列，不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是从这些垃圾中挑选
测、哪些基因推荐检测、哪些基因有一定的检测价值，这些需要阐述清楚。
最后，根据患者的经济情况与病情，综合选择（这是理想状况）。
实际操作过程中，销售经理往往会以经济利益为导向。
1.3：
临床信息。
患者的临床信息对于基因检测报告者有重要意义，信息掌握越全面报告越个性化，咨询解读也更有针对性。
因此，完整详实的临床申请单需要提供。
程序二：
实验部分
2.1：
样本类型。
需要明确一点，能够运用无创的尽量用无创（唾液与血液），因为没有一个患者希望无缘无故的在自己身上打洞。
固体：
手术样本，穿刺样本，石蜡包埋组织，石蜡切片组织；
液体：
全血，血清血细胞，胸水，腹水，唾液。
1）手术样本：
（肿瘤组织≥50mg，癌旁正常组织≥25mg，收到组织后立即用至少5倍体积的10%中性福尔马林固定液固定），切片25张以上，厚度5μm，肿瘤细胞占比≥50%，坏死组织区域2）穿刺样本：
穿刺一针以上，肿瘤细胞占比≥50%，坏死组织区域3）石蜡包埋组织：
常温保存运输即可，最好是1年以内。
4）石蜡切片组织：
常温保存运输即可，最好是6周以内。
5）全血：
6ml-10mlforNGS（Streck管，含有保存液，负压真空抽满），轻轻垂直平面90°
旋转10次，6-25℃（常温）运输，3（7）日内送达，可用干冰/制热剂制造维持环境温度。
6）血浆血细胞（普通试管）：
抽血后2h内将全血4℃1600g离心10min，分别收集上清和沉淀至离心管中；
上清再4°
C16000g离心10min，收集上清血浆转移至15mL离心管中。
血浆血细胞样品，均封口膜封口，干冰运输。
7）胸水：
8）腹水：
这两个情况比较少，至少我们公司很少遇到这样的样本。
2.2：
质控。
血液样本是否合格，是否可以进行测序上机，样本质量怎么样？
安捷伦2100生物分析仪或者4200TapeStation核酸分析仪，通过DNA完整值（DIN）来数字化基因组DNA的完整性。
如果不用这些仪器，可以通过跑胶来实现这一步。
质控不合格，只有重新采样。
标准流程只需要0.1-1μgDNA，DNA的OD260/280在1.8-2.0之间，RNA的RIN值≥8.0。
实验中发现，只要RIN值大于7，就可以获得比较满意的结果。
（RIN：
RNA完整值）。
总的来说，质控两个指标：
1）足够的DNA量；
2）完整的DNA基因组。
这个步骤在构建文库后上机测序前完成。
2.3：
文库构建。
简而言之，获取足够量的/目的的/前期适合上机测序而标准处理的DNA。
其程序主要有：
片段化，连接，扩增。
1）片段化：
我们总不能直接将那么长的DNA去测序吧，测序仪就只能一次测几百bp的DNA，超声波片段化等方法，获得DNA片段为正态分布200-500bp，通过一定方法（切割琼脂糖凝胶电泳条带）选择所需长度的DNA片段（150-200bp），其它的片段就扔了（不影响覆盖范围）。
2）末端修补：
上面的方法（物理方法）片段化的DNA，一般来说两端都被破坏了，不再是平平整整的了，而后续步骤需要在两端加测序接头，所以我们得先把这个破坏的两端修补好。
修补所需三种酶：
5‘端延伸的酶，5’端连接的酶，3‘端延伸的酶。
3）3’端加A：
片段化且两端修补好的DNA，3‘端加上一个碱基A，而下一步骤的连接接头3’端有一个碱基T，这样就实现了碱基互补而连接起来了。
这样做还有以下几个原因：
提供连接效率；
防止接头与DNA片段多种方向连接；
减少接头之间的连接。
值得一提的是1）2）3）的步骤可以用WGSFramentationMix搞定。
4）两端加接头：
首先明确接头3‘端有一个突出的碱基T，插入片段3’端有一个突出的碱基A；
其次，这个工序是在插入片段两端加入东西；
这个东西包括以下几个部分：
测序接头（P5，P7；
测序时用于与种植在FlowCell上的序列碱基互补配对用），Barcode（用于标识该条DNA片段属于哪个样本，4个碱基），单分子编码序列（Index，用于识别是哪条DNA片段，12个随机碱基）；
其中Y型的序列是已经商业化的试剂盒。
5）PCR富集：
如果样本不够，那么我们就需要扩增它才能上机测序，这就是该环节存在的必要。
由于每个经4）处理的片段两端都有P5与P7，因此PCR引物只需设计与它们配对的就行了。
如果样本足够，这一步就省了呗。
6）文库定量：
这里才应该是质控，也就是2.2的步骤。
7）基因捕获：
我们只将需要的DNA片段去测序，不需要的去测不是浪费钱吗？
于是在测序之前，我们就用这个工序将目的DNA挑选出来（为什么要捕获）；
目前目标序列捕获方法有3种，NimbleGesnSequenceCapturearray，AgilentSureSelectDNACaptureArray，AgilentSureSelectTargetEnrichmentSystem，值得注意的是不同捕获方法可能测序仪器有不同的要求（捕获的方法有哪些；
罗氏和安捷伦）；
我们捕获的探针设计可以自己设计，初步设计，需要检测的位点提交到商业公司，真正的设计还是需要专业的商业公司来干（捕获探针的由来）；
例如目标区域为100Kb，好的探针是100%覆盖这100Kb，而有的商业公司达不到，只能覆盖到97%，那么意味着有3%的区域捕获不到，更谈不上对这些区域测序了，所以覆盖率很重要；
对于这100Kb的目标片段，前10Kb探针捕获了100个片段，第10Kb-20Kb的探针捕获了10个片段，那么这样的话就是均一性不好，最终可能会得出结论10Kb-20Kb这一段突变频率过高/过低，因此均一性很重要；
如果一个探针设计出来想捕获目标片段，却捕获到了别的垃圾片段，我们还对它测序，这不是浪费钱吗？
所以，探针特异性很重要。
（好的捕获是怎么样的）。
8）PCR扩增：
PCR再次扩增捕获的DNA片段，上机前再一次加足样本量。
9）文库再次定量：
相当于上机前的再一次质量检测。
2.4：
上机测序。
通过前面的步骤，我们从患者身上的一块肿瘤组织或者一管血开始，然后分离提纯我们需要的基因组DNA，再把这些DNA打成小片段，然后再在这些DNA小片段两头接上识别标记和测序接头，最后再通过基因捕获技术筛选出目的DNA，根据需求PCR扩增。
通过这么多步骤，就是为上机测序做准备。
一句话，上机测序的过程就是读取这些DNA小片段的序列，如ATCTGGCTT...（~160bp），这样万级、亿级的DNA片段个数。
至于这些DNA片段是怎么样在机器上被测出来的，这又是个大问题，我在《液体活检有哪些》这篇文章有简要说明，这里不管它，毕竟世界上那么多事情，哪有想管就管得了的呢？
至此，实验部分结束。
程序三：
信息分析部分
3.1：
下机数据识别。
数以亿计的DNA小片段，一大饼，杂乱无章，很多情况是几十个患者的样本都一起的，更乱。
一句话，这个步骤将属于不同患者的DNA小片段放进不同的盒子里，分类。
这是怎么实现的呢？
我们在构建文库的加接头步骤时，同时加上了Barcode序列，同一个患者使用同一个Barcode，不同的患者使用不同的Barcode，那么计算机通过这个Barcode轻松识别然后放进不同的盒子里。
值得注意的是，DNA是两条链，有的公司会两条链同时测序以增加准确性，因此一个A患者会有两个盒子属于他（A1：
正义链的DNA小片段集合；
A2：
反义链的DNA小片段集合）。
还值得注意的是，如果样本是血液，有的公司会同时检测cfDNA和gDNA，那么一个B患者就会有四个盒子属于他（B1，B2，B3，B4）。
3.2：
图像转换。
下机的时候那些DNA片段最初其实是图像格式的，例如红色表示碱基A，绿色表示碱基T，需要用专业工具将图像格式转换成序列。
Illumina公司提供专业软件，只需对其调用就可以完成这一步骤。
一句话：
图像转换成序列。
3.3：
比对到基因图上。
将这些上以亿级的DNA小片段归位，如果你是1号染色体的第500位到第650位之间的片段，就把你归到这个位置下面。
当然，1号染色体上的这个位置下面一般不止一条DNA片段，毕竟有一个概念叫做测序深度，如果测序深度为10000，那么理论上该位置下面就应该有10000条DNA片段。
怎么控制是10000条呢？
这在上机之前构建文库时，通过调节PCR扩增来实现。
将散乱的DNA小片段比对到参考基因组上，从而实现它们的定位。
这个参考基因组是国际权威数据库给出的，供给全世界所有人使用。
基因组：
http:
//hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/；
比对软件BWA：
//bio-
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