低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践Word格式.docx

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　　1.2药品与试剂二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、巯基乙醇（β-ME）、过硫酸铵、甘氨酸、琼脂粉、三乙胺、浓盐酸、氯化钠和咪唑（国药集团化学试剂有限公司）;

蛋白胨、酵母提取物（英国Oxoid公司）;

3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）、异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（美国Thermo公司）;

BCA（bicinchoninicacid）蛋白浓度测定试剂盒、青霉素—链霉素双抗（P-S双抗）、卡那霉素、四甲基乙二胺、胰酶消化液（上海碧云天生物技术研究所）;

Ellman试剂（上海沃凯生物技术有限公司）;

异硫氰酸荧光素（FITC，探索生物有限科技公司）;

四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Sigma-Aldrich公司）;

1640细胞培养基、澳洲血源胎牛血清（美国Gibco公司）;

实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

　　1.3主要仪器Ni2+-NTA亲和层析树脂（美国Novagen公司）;

PWVF纯水仪、HF90细胞培养箱（美国HealForce公司）;

IX81倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）;

LDZX-50KBS高温高压灭菌锅（上海申安医疗器械）;

微孔滤膜（美国Millipore公司）;

MutifugeX1R低温高速离心机（美国Thermo公司）;

PurifierUPC快速蛋白液相色谱（fastproteinliquidchromatography，FPLC）、肝素亲和色谱柱（美国通用电气公司）;

BT25S电子天平（德国赛多利斯科学仪器公司）;

LAB850酸度计（德国肖特股份有限公司）;

THZ-D台式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）;

GelDocXR凝胶成像系统、Mini-protean蛋白电泳仪（美国伯乐公司）;

JY92-IIN超声波细胞破碎机（宁波新芝生物技术股份有限公司）。

　　1.4TCS重组蛋白的构建、表达通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因序列数据库，构建TCS的质粒，并以此为模板，在其3’端插入10个天冬酰胺和1个半胱氨酸编码序列，并将此突变体命名为TCS-10N-C。

经测序正确后，将TCS、TCS-10N-C的质粒转化BL21（DE3）菌株，涂布于含50μg/mL卡那霉素的固体培养基中过夜培养。

次日挑取阳性克隆接种于1mL的LB培养液中（含卡那霉素50μg/mL），37°

C振摇培养至600nm的吸光度值（D值）为~左右，按1∶100转接至新的LB培养基，37°

C摇床扩充培养至600nm的D值为~左右，加入IPTG至终浓度为10mmol/L，室温诱导表达8h。

8000r/min、4℃离心收菌，最后用Washbuffer（20mmol/LNaH2PO4、50mmol/LNaCl、pH）稀释菌液至原来培养基体积的4%。

　　1.5重组蛋白的纯化将诱导后的大肠杆菌置-80°

C超低温冰箱，反复冻融3次。

然后冰浴探头超声破碎菌液90min，最后8000r/min、4°

C离心30min，取上清。

重组蛋白使用Ni2+-NTA树脂进行纯化。

先加入5倍柱体积的上清液，然后以5倍柱体积的Washbuffer洗脱非特异性吸附的蛋白，继续用5倍柱体积的50mmol/L咪唑缓冲液（Washbuffer，50mmol/L咪唑，pH）洗脱低吸附的蛋白，再用5倍柱体积的500mmol/L咪唑缓冲液（Washbuffer，500mmol/L咪唑，pH）洗脱目的蛋白，目的蛋白4℃保存。

最后用5倍柱体积的1mol/L咪唑缓冲液（Washbuffer，1mol/L咪唑，pH）洗脱所有蛋白重生柱子，用5倍柱体积的Washbuffer洗脱咪唑，体积分数20%乙醇4°

C保存。

将目的蛋白用10倍体积超纯水稀释，过μm微孔滤膜，采用快速蛋白收集仪（FPLC）进行纯化，选用肝素亲和色谱柱进行分离。

分离条件：

A相（20mmol/LNaH2PO4、1mmol/LEDTA，），B相（20mmol/LNaH2PO4、1mmol/LEDTA、2mol/LNaCl，pH）。

以mL/min的流速进行进样，然后以1mL/min流速，100%的A相把基线冲平，1mL/min的流速，0~10%的B相进行线性洗脱，收集电导率18ms/cm左右出现的紫外吸收峰，4°

C保存，并取适量蛋白进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳进行鉴定。

TCS-10N-C采用Ellman试剂测定游离巯基。

　　1.6低分子量鱼精蛋白活化酯（LMWP-PDP）的制备按摩尔比为1∶5∶的比例分别称取LMWP、SPDP与三乙胺，溶于1mLDMF，室温避光反应4h。

反应后加入10倍体积超纯水终止反应，以8000r/min离心20min，取上清过μm微孔滤膜，用FPLC进行纯化。

上样条件参考项，上样后用100%A相冲平基线，再以1mL/min的流速，0~100%B相进行线性洗脱，收集电导率70ms/cm左右出现的紫外吸收峰。

样品收集后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

　　1.7天花粉蛋白—低分子量鱼精蛋白复合物（TCS-10N-SS-LMWP，TSSL）的制备、纯化向TCS-10N-C的溶液中，加入TCS的巯基8倍摩尔量的LMWP-PDP，4°

C振摇反应12h。

反应后，加入10倍体积的超纯水进行稀释，按项方法进行纯化，收集电导率70ms/cm左右出现的紫外吸收峰。

收集到的样品，使用超滤管进行浓缩，浓缩到原来体积的1/10后，再加入9倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS），重复3次，把溶剂替代为PBS。

所得蛋白用SDS-PAGE检测。

　　1.8还原性物质的响应性实验取2份等量的TSSL，1份加入含体积分数5%巯基乙醇的5×

loadingbuffer，1份是不含巯基乙醇的5×

loadingbuffer，置沸水10min后，进行SDS-PAGE鉴定。

　　1.9蛋白FITC标记将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。

按摩尔比为蛋白质∶FITC=1∶10的比例将FITC缓慢加入于蛋白溶液中，边加边轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处4°

C反应8h。

加入5mol/L的甘氨酸至终浓度50mmol/L，4°

C终止反应2h。

采用SephadexG50凝胶纯化，去除游离荧光素，制得FITC-TCS与FITC-TSSL，贮存于4℃中。

　　1.10细胞摄取实验将对数生长期的MCF-7和HeLa细胞用g/L的胰蛋白酶消化，并用新鲜的培养基将其稀释成一定的浓度，吸取一定量消化好的细胞均匀种入24孔培养板，使每孔的细胞密度均约为10×

104/孔，细胞培养箱的条件为37°

C、体积分数5%CO2，培养时间为24h。

用1640培养基稀释FITC-TCS与FITC-TSSL，浓度同为3μmol/L。

吸去细胞培养基，加入含药培养基500μL，培养箱中孵育4h。

吸去培养基，用500μLPBS浸泡5min，吸去PBS，再加入PBS，重复3次，最后剩余200μLPBS，置荧光显微镜中观察细胞的形态以及荧光强度。

　　1.11细胞毒性实验取对数生长期MCF-7和HeLa细胞，调整细胞浓度至5×

104/mL，每孔100μL接种96孔培养板内。

于培养板均加入TCS、TSSL，终浓度为400、200、100、50、25、、、、0μg/mL，每个浓度6个复孔，孵育48h。

48h后吸去培养基，加入90μL1640培养基和5g/LMTT溶液10μL。

孵育4h后，吸去培养基，加入100μLDMSO，避光振摇15min，在酶标仪上测定490nm波长下的D值，计算各组细胞的抑制率：

p细胞抑制（%）=（D对照组-D实验组）/D对照组×

100%。

使用统计软件SPSS计算药物的半数抑制浓度（IC50）。

　　2结果

　　2.1TCS重组蛋白的制备通过蛋白重组技术，将TCS与TCS-10N-C的克隆入载体，转化，使TCS与TCS-10N-C在宿主菌内大量融合表达。

经Ni2+-NTA亲和层析柱，肝素亲和色谱柱的进一步纯化，TCS和TCS-10N-C大约在电导率18ms/cm时被洗脱下来，如图1所示。

图2显示，经SDS-PAGE鉴定，蛋白条带均一，且杂质较少。

TCS的分子量大约为27kD左右，与理论分子量相符。

TCS-10N-C由于比TCS多了10个天冬酰胺和半胱氨酸，所以分子量大概比TCS大1~2kD左右。

10N可作为连接臂（spacer），有利于半胱氨酸暴露于蛋白表面，从而有利于下一步的化学偶联反应。

　　2.2TSSL的制备TSSL的制备原理，LMWP氨基与SPDP的琥珀酰亚胺酯反应后，得到LMWP-PDP。

由于LMWP在280nm的紫外检测器下无强吸收峰，反应得到LMWP-PDP则在电导率70ms/cm出现强吸收峰，说明LMWP-PDP制备成功。

LMWP-PDP再与TCS-10N-C进行偶联，经肝素色谱柱纯化，收集目的蛋白，如图4-B所示。

所得TSSL经SDSPAGE检测，如图5所示，TSSL纯度较高，虽然存有少量TCS-10N-C未能去除，但是其纯度足以进行下一步实验。

　　2.3TSSL的还原响应敏感性经SDS-PAGE鉴定，在巯基乙醇的作用下，TSSL的二硫键被打开，被还原成TCS-10N-C，分子量减少，条带下移。

由此推测TSSL能在肿瘤还原性环境中被还原，从而释放出TCS。

而没有加入巯基乙醇的TSSL，没有被还原，所以其条带除了部分没被除去的TCS-10N-C，大部分均为TSSL，与电泳结果相符。

　　2.4肿瘤细胞对药物的摄取作用HeLa和MCF-7肿瘤细胞对TCS和TSSL的摄取作用如所示。

经过HeLa与MCF-74h的摄取作用后，TSSL组（图7-D、H）出现绿色荧光，且TSSL组的绿色荧光强于TCS组（图7-B、F），提示LMWP的转运作用能够提高肿瘤细胞对TCS的摄取效率。

　　2.5药物的肿瘤杀伤作用图8、9显示：

经LMWP修饰后，TCS-10N-SS-LMWP对HeLa、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用有了极大的提高，呈剂量依赖关系，随药物浓度的升高，其细胞增长抑制率逐渐上升。

在HeLa细胞中，TCS、TSSL的IC50分别为、μg/mL，而在MCF-7细胞的IC50分别为、μg/mL，2种细胞的杀伤力均提高6倍以上，提示LMWP的高效运转能够极大提高TCS抗肿瘤作用。

　　3讨论

　　早在两千年前的《神农本草经》中，就有天花粉“功效味苦寒，主消渴身热、满烦大热，补虚”的记载;

明代《本草纲目》中对天花粉的来源、性状有总结性论述，并将天花粉的功效归纳为“通月水，治胞衣不下”。

历代临床经验证明，天花粉性味甘、微苦，微寒，归肺、胃经，具有清热生津、消肿排脓的功效，主治热病口渴、消渴、黄疸、肺燥咳血、痈肿、痔痿。

　　从天花粉中分离出的TCS被证实为药物的主要有效成分，并得到了广泛应用，多项研究成果也已被成功应用于临床。

TCS是一种碱性（pH）的单链蛋白质，分子量为27kDa，具有RNA-N-糖苷酶活性，能水解真核细胞核糖体28SrRNA4324位上腺苷酸N-C糖苷键，释放出1个腺嘌呤碱基，使核糖体不可逆失活，从而抑制蛋白质合成。

研究显示：

TCS具有强抗肿瘤活性，能够诱导HeLa细胞形态学改变，包括微绒毛消失、细胞膜发泡，染色质浓缩，凋亡小体形成，出现DNA梯带;

TCS抑制细胞增殖的机制与细胞周期S期阻滞和诱导细胞内caspase凋亡通路活化有关。

同样，TCS也能抑制MCF-7细胞的增殖，阻滞细胞S期，并激活caspase-8，9途径，使线粒体膜电位耗散，引起细胞凋亡，从而有效抑制实体瘤的增长。

TCS通过介导细胞内核糖体失活而发挥抗肿瘤作用，细胞内TCS的浓度与TCS的细胞毒性相关，所以TCS对于不同肿瘤细胞的杀伤力可能与细胞的内化机制有关。

据有关研究表明，蛋白药物经过穿膜肽修饰后，能有效提高细胞摄取率以及肿瘤杀伤作用，如LMWP、反式转录调节蛋白（TAT肽）与多花白树毒蛋白（gelonin）连接后，能有效降低多花白树毒蛋白的IC50，极大地提高药物的生物活性。

本研究结果显示：

通过蛋白重组技术可成功表达TCS与TCS-10N-C，并利用交联剂SPDP使TCS-10N-C与LMWP进行连接。

经过穿膜肽修饰后，由于LMWP的运转作用，携带其进入细胞内，通过肿瘤细胞内丰富的还原物质，如谷胱甘肽，使TCS-10N-SS-LMWP的二硫键打开，定点释放TCS，增加细胞内TCS的浓度，极大地提高了TCS对HeLa、MCF-7细胞的杀伤作用。

　　故本研究采用蛋白重组技术与化学偶联技术结合，使TCS定点连接LMWP，通过LMWP的转运作用，以及利用肿瘤还原性环境定点释放，增加TCS细胞内的累积量，提高肿瘤杀伤作用。

可为将TCS开发成为具有实际抗肿瘤价值的临床用药提供新的思路和技术手段，体现了传统中药与现代基因工程的有机结合以及中医药的先进性与科学性。