低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践Word格式.docx

1、1. 2 药品与试剂二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、巯基乙醇（-ME）、过硫酸铵、甘氨酸、琼脂粉、三乙胺、浓盐酸、氯化钠和咪唑（国药集团化学试剂有限公司）; 蛋白胨、酵母提取物（英国Oxoid 公司）; 3-（ 2 - 吡啶二巯基） 丙酸N - 羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP） 、异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（美国Thermo 公司）; BCA （bicinchoninic acid） 蛋白浓度测定试剂盒、青霉素链霉素双抗（P-S 双抗）、卡那霉素、四甲基乙二

2、胺、胰酶消化液（上海碧云天生物技术研究所）; Ellman 试剂（上海沃凯生物技术有限公司）; 异硫氰酸荧光素（FITC，探索生物有限科技公司）; 四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Sigma-Aldrich 公司）; 1640 细胞培养基、澳洲血源胎牛血清（美国Gibco 公司）; 实验用水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。1. 3 主要仪器Ni2+-NTA 亲和层析树脂（美国Novagen 公司）; PWVF 纯水仪、HF90 细胞培养箱（美国Heal Force 公司）; IX81 倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司）; LDZX-50KBS 高温高压灭菌锅（上海申安医疗器械）; 微孔滤

3、膜（美国Millipore 公司）; Mutifuge X1R 低温高速离心机（美国Thermo公司）; Purifier UPC 快速蛋白液相色谱（fast proteinliquid chromatography， FPLC） 、肝素亲和色谱柱（美国通用电气公司）; BT25S 电子天平（德国赛多利斯科学仪器公司）; LAB850 酸度计（德国肖特股份有限公司）; THZ-D 台式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）; GelDoc XR 凝胶成像系统、Mini-protean 蛋白电泳仪（美国伯乐公司）; JY92-IIN 超声波细胞破碎机（宁波新芝生物技术股份有限公司）。1. 4 T

4、CS 重组蛋白的构建、表达通过美国国立生物技术信息中心（NCBI） 基因序列数据库， 构建TCS 的质粒， 并以此为模板， 在其3端插入10个天冬酰胺和1 个半胱氨酸编码序列， 并将此突变体命名为TCS-10N-C。经测序正确后， 将TCS、TCS-10N-C 的质粒转化 BL21 （DE3） 菌株，涂布于含50 g/mL 卡那霉素的固体培养基中过夜培养。次日挑取阳性克隆接种于1 mL 的LB 培养液中（含卡那霉素50 g/mL）， 37C 振摇培养至600 nm 的吸光度值（D 值） 为 左右， 按1 100 转接至新的LB 培养基， 37C 摇床扩充培养至600 nm 的D 值为 左右，

5、加入IPTG 至终浓度为10 mmol/L， 室温诱导表达8 h。8 000r/min、4 离心收菌， 最后用Wash buffer （ 20mmol/L NaH2PO4、50 mmol/L NaCl、pH ） 稀释菌液至原来培养基体积的4%。1. 5 重组蛋白的纯化将诱导后的大肠杆菌置-80C 超低温冰箱， 反复冻融3 次。然后冰浴探头超声破碎菌液90 min， 最后8 000 r/min、4C 离心30 min， 取上清。重组蛋白使用Ni2+-NTA 树脂进行纯化。先加入5 倍柱体积的上清液， 然后以5 倍柱体积的Wash buffer 洗脱非特异性吸附的蛋白，继续用5 倍柱体积的50 m

6、mol/L 咪唑缓冲液（Washbuffer， 50 mmol/L 咪唑， pH ） 洗脱低吸附的蛋白， 再用5 倍柱体积的500 mmol/L 咪唑缓冲液（Wash buffer， 500 mmol/L 咪唑， pH ） 洗脱目的蛋白， 目的蛋白4保存。最后用5 倍柱体积的1 mol/L 咪唑缓冲液（Wash buffer， 1 mol/L 咪唑，pH ） 洗脱所有蛋白重生柱子， 用5 倍柱体积的Wash buffer 洗脱咪唑， 体积分数20%乙醇4C 保存。将目的蛋白用10 倍体积超纯水稀释， 过m 微孔滤膜， 采用快速蛋白收集仪（FPLC） 进行纯化， 选用肝素亲和色谱柱进行分离。分离

7、条件：A 相（20 mmol/L NaH2PO4、1 mmol/L EDTA， ）， B 相（20 mmol/L NaH2PO4、1 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl， pH ）。以 mL/min 的流速进行进样， 然后以1 mL/min 流速， 100%的A 相把基线冲平， 1 mL/min 的流速， 0 10%的B 相进行线性洗脱， 收集电导率18 ms/cm 左右出现的紫外吸收峰， 4C 保存， 并取适量蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE） 凝胶电泳进行鉴定。TCS-10N-C 采用Ellman 试剂测定游离巯基。1. 6 低分子量鱼精蛋白活化酯（LMWP

8、-PDP）的制备按摩尔比为1 5 的比例分别称取LMWP、SPDP 与三乙胺， 溶于1 mL DMF， 室温避光反应4 h。反应后加入10 倍体积超纯水终止反应， 以8 000 r/min 离心20 min， 取上清过m 微孔滤膜， 用FPLC 进行纯化。上样条件参考 项， 上样后用100% A 相冲平基线， 再以1mL/min 的流速， 0 100% B 相进行线性洗脱， 收集电导率70 ms/cm 左右出现的紫外吸收峰。样品收集后， 使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行测定。1. 7 天花粉蛋白低分子量鱼精蛋白复合物（TCS-10N-SS-LMWP， TSSL） 的制备、纯化向TCS-10N

9、-C 的溶液中， 加入TCS 的巯基8 倍摩尔量的LMWP-PDP， 4C 振摇反应12 h。反应后，加入10 倍体积的超纯水进行稀释， 按 项方法进行纯化， 收集电导率70 ms/cm 左右出现的紫外吸收峰。收集到的样品， 使用超滤管进行浓缩， 浓缩到原来体积的1/10 后， 再加入9 倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS）， 重复3 次， 把溶剂替代为PBS。所得蛋白用SDS-PAGE 检测。1. 8 还原性物质的响应性实验取2 份等量的TSSL， 1 份加入含体积分数5%巯基乙醇的5 loading buffer， 1 份是不含巯基乙醇的5 loadingbuffer， 置沸水10 min 后，

10、 进行SDS-PAGE 鉴定。1. 9 蛋白FITC 标记将FITC 溶于DMSO 中， 浓度为1 mg/mL。按摩尔比为蛋白质 FITC=1 10 的比例将FITC 缓慢加入于蛋白溶液中， 边加边轻轻晃动使其与蛋白混合均匀， 暗处4C 反应8 h。加入5 mol/L 的甘氨酸至终浓度50 mmol/L， 4C 终止反应2 h。采用SephadexG 50 凝胶纯化， 去除游离荧光素， 制得FITC-TCS 与FITC- TSSL， 贮存于4中。1. 10 细胞摄取实验将对数生长期的MCF-7 和HeLa 细胞用 g/L 的胰蛋白酶消化， 并用新鲜的培养基将其稀释成一定的浓度， 吸取一定量消化

11、好的细胞均匀种入24 孔培养板， 使每孔的细胞密度均约为10 104/孔， 细胞培养箱的条件为37C、体积分数5%CO2， 培养时间为24 h。用1640 培养基稀释FITC-TCS 与FITC- TSSL， 浓度同为3 mol/L。吸去细胞培养基， 加入含药培养基500 L， 培养箱中孵育4 h。吸去培养基， 用500 L PBS 浸泡5min， 吸去PBS， 再加入PBS， 重复3 次， 最后剩余200 L PBS， 置荧光显微镜中观察细胞的形态以及荧光强度。1. 11 细胞毒性实验取对数生长期MCF-7 和HeLa 细胞， 调整细胞浓度至5 104/mL， 每孔100L 接种96 孔培养

12、板内。于培养板均加入TCS、TSSL， 终浓度为400、200、100、50、25、0 g/mL， 每个浓度6 个复孔， 孵育48 h。48 h 后吸去培养基， 加入90 L 1640 培养基和5 g/L MTT 溶液10 L。孵育4 h 后， 吸去培养基， 加入100 L DMSO， 避光振摇15 min， 在酶标仪上测定490 nm 波长下的D 值， 计算各组细胞的抑制率： p细胞抑制（%）=（D对照组-D实验组）/ D对照组100%。使用统计软件SPSS 计算药物的半数抑制浓度（IC50）。2 结果2. 1 TCS 重组蛋白的制备通过蛋白重组技术，将TCS 与TCS-10N-C 的克隆入

13、载体， 转化， 使TCS 与TCS-10N-C 在宿主菌内大量融合表达。经Ni2+-NTA 亲和层析柱， 肝素亲和色谱柱的进一步纯化， TCS 和TCS-10N-C 大约在电导率18 ms/cm 时被洗脱下来， 如图1 所示。图2 显示，经SDS-PAGE 鉴定， 蛋白条带均一， 且杂质较少。TCS 的分子量大约为27 kD 左右， 与理论分子量相符。TCS-10N-C 由于比TCS 多了10 个天冬酰胺和半胱氨酸， 所以分子量大概比TCS 大12 kD 左右。10N 可作为连接臂（spacer）， 有利于半胱氨酸暴露于蛋白表面， 从而有利于下一步的化学偶联反应。2. 2 TSSL 的制备TS

14、SL 的制备原理， LMWP 氨基与SPDP 的琥珀酰亚胺酯反应后，得到LMWP-PDP。由于LMWP 在280 nm 的紫外检测器下无强吸收峰， 反应得到LMWP-PDP 则在电导率70 ms/cm 出现强吸收峰，说明LMWP -PDP 制备成功。LMWP -PDP 再与TCS-10N-C 进行偶联， 经肝素色谱柱纯化， 收集目的蛋白， 如图4-B 所示。所得TSSL 经SDSPAGE检测， 如图5 所示， TSSL 纯度较高， 虽然存有少量TCS-10N-C 未能去除， 但是其纯度足以进行下一步实验。2. 3 TSSL 的还原响应敏感性经SDS-PAGE 鉴定， 在巯基乙醇的作用下， TS

15、SL 的二硫键被打开， 被还原成TCS-10N-C， 分子量减少， 条带下移。由此推测TSSL 能在肿瘤还原性环境中被还原， 从而释放出TCS。而没有加入巯基乙醇的TSSL，没有被还原， 所以其条带除了部分没被除去的TCS-10N-C， 大部分均为TSSL， 与电泳结果相符。2. 4 肿瘤细胞对药物的摄取作用HeLa 和MCF-7肿瘤细胞对TCS 和TSSL 的摄取作用如所示。经过HeLa 与MCF-7 4 h 的摄取作用后， TSSL 组（图7-D、H） 出现绿色荧光， 且TSSL 组的绿色荧光强于TCS 组（图7-B、F）， 提示LMWP 的转运作用能够提高肿瘤细胞对TCS 的摄取效率。2

16、. 5 药物的肿瘤杀伤作用图8、9 显示： 经LMWP 修饰后， TCS -10N -SS -LMWP 对HeLa、MCF-7 肿瘤细胞的抑制作用有了极大的提高， 呈剂量依赖关系， 随药物浓度的升高， 其细胞增长抑制率逐渐上升。在HeLa 细胞中， TCS、TSSL 的IC50分别为、 g/mL， 而在MCF-7 细胞的IC50分别为、 g/mL， 2 种细胞的杀伤力均提高6 倍以上， 提示LMWP 的高效运转能够极大提高TCS 抗肿瘤作用。3 讨论早在两千年前的神农本草经中， 就有天花粉“功效味苦寒， 主消渴身热、满烦大热， 补虚”的记载; 明代本草纲目中对天花粉的来源、性状有总结性论述，

17、并将天花粉的功效归纳为“通月水， 治胞衣不下”。历代临床经验证明， 天花粉性味甘、微苦， 微寒， 归肺、胃经， 具有清热生津、消肿排脓的功效， 主治热病口渴、消渴、黄疸、肺燥咳血、痈肿、痔痿。从天花粉中分离出的TCS 被证实为药物的主要有效成分， 并得到了广泛应用， 多项研究成果也已被成功应用于临床。TCS 是一种碱性（pH ） 的单链蛋白质， 分子量为27 kDa， 具有RNA-N-糖苷酶活性， 能水解真核细胞核糖体28S rRNA 4324位上腺苷酸N-C 糖苷键， 释放出1 个腺嘌呤碱基，使核糖体不可逆失活， 从而抑制蛋白质合成。研究显示： TCS 具有强抗肿瘤活性， 能够诱导HeLa细

18、胞形态学改变， 包括微绒毛消失、细胞膜发泡，染色质浓缩， 凋亡小体形成， 出现DNA 梯带;TCS抑制细胞增殖的机制与细胞周期S 期阻滞和诱导细胞内caspase 凋亡通路活化有关。同样， TCS也能抑制MCF-7 细胞的增殖， 阻滞细胞S 期， 并激活caspase-8，9 途径， 使线粒体膜电位耗散， 引起细胞凋亡， 从而有效抑制实体瘤的增长。TCS 通过介导细胞内核糖体失活而发挥抗肿瘤作用， 细胞内TCS 的浓度与TCS 的细胞毒性相关，所以TCS 对于不同肿瘤细胞的杀伤力可能与细胞的内化机制有关。据有关研究表明， 蛋白药物经过穿膜肽修饰后， 能有效提高细胞摄取率以及肿瘤杀伤作用， 如L

19、MWP、反式转录调节蛋白（TAT 肽） 与多花白树毒蛋白（gelonin） 连接后， 能有效降低多花白树毒蛋白的IC50， 极大地提高药物的生物活性。本研究结果显示： 通过蛋白重组技术可成功表达TCS 与TCS -10N-C， 并利用交联剂SPDP 使TCS-10N-C 与LMWP 进行连接。经过穿膜肽修饰后， 由于LMWP 的运转作用， 携带其进入细胞内，通过肿瘤细胞内丰富的还原物质， 如谷胱甘肽， 使TCS -10N-SS-LMWP 的二硫键打开， 定点释放TCS， 增加细胞内TCS 的浓度， 极大地提高了TCS对HeLa、MCF-7 细胞的杀伤作用。故本研究采用蛋白重组技术与化学偶联技术结合， 使TCS 定点连接LMWP， 通过LMWP 的转运作用， 以及利用肿瘤还原性环境定点释放， 增加TCS 细胞内的累积量， 提高肿瘤杀伤作用。可为将TCS 开发成为具有实际抗肿瘤价值的临床用药提供新的思路和技术手段， 体现了传统中药与现代基因工程的有机结合以及中医药的先进性与科学性。