生物基因的研究 中英Word格式文档下载.docx

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限制向内切酶和DNA连接酶的多样性，使得我们可以将DNA序列当做模块，一段DNA序列被移动到其他DNA序列中是可行的。

因此，核酸酶学是重组DNA技术的基础。

Asecondfoundationisthebase-pairinglanguagethatallowscomplementarysequencestorecognizeandbindtoeachother.HybridizationwithcomplementaryDNAorRNAprobesisasensitiveandpowerfulmeansofdetectingspecificnucleotidesequences.InrecombinantDNAtechnology,base-pairingisusedtoconstructnewcombinationsofDNAaswellastodetectandamplifyparticularsequences.Thisrevolutionarytechnologyisalsocriticallydependentonourunderstandingofviruses,theultimateparasites.VirusesefficientlydelivertheirownDNA（orRNA）intohosts,subvertingthemeithertoreplicatetheviralgenomeandproduceviralproteinsortoincorporateviralDNAintothehostgenome.Likewise,plasmids,whichareaccessorychromosomesfoundinbacteria,havebeenindispensableinrecombinantDNAtechnology.

第二个基础是碱基互补配对原则，使得互补序列可以相互识别和结合。

与互补的DNA或RNA探针的杂交是一个敏感的和强有力检测特定核苷酸序列的方法。

在重组DNA技术中，碱基配对被用来构建新的DNA的组合，也可以用来检测和放大特定的序列。

这一革命性的技术也严重性的依赖我们对病毒的理解，最终是是寄生虫。

病毒可以将他们的DNA（RNA）高效的转入宿主细胞，颠覆宿主细胞，使其复制病毒的基因组并生产病毒蛋白，或者经自己的基因直接整合到宿主细胞。

同样，在大肠杆菌发现的染色体附件-质粒，在重组DNA技术中也是不可或缺的。

Thesenewmethodshavewide-rangingbenefits.Entiregenomes,includingthehumangenome,arebeingdeciphered.Newinsightsareemerging,forexample,intotheregulationofgeneexpressionincanceranddevelopmentandtheevolutionaryhistoryofproteinsaswellasorganisms.Newproteinscanbecreatedbyalteringgenesinspecificwaystoprovidedetailedviewsintoproteinfunction.Clinicallyusefulproteins,suchashormones,arenowsynthesizedby

recombinantDNAtechniques.Cropsarebeinggeneratedtoresistpestsandharshconditions.ThenewopportunitiesopenedbyrecombinantDNAtechnologypromisetohavebroadeffects.

这种新方法具有广泛的利益。

对于整个基因组，包括人类基因组，都被破译了。

新的见解兴盛，列如，癌症的发展及表达和调节，蛋白质和生物体的演变历史。

通过改变特定基因的方法生产新的蛋白，这样可以为蛋白质的作用机理提供详细的意见。

临床用蛋白质，列如，激素，正在通过重组DNA技术合成。

正在是农作物具有杭虫和抗恶劣条件的性能。

通过重组DNA技术，新的机会定会带来更广泛的用途。

Processessuchasdevelopmentfromacaterpillarintoabutterflyinvolvedramaticchangesinpatternsofgeneexpression.TheexpressionlevelsofthousandsofgenescanbemonitoredthroughtheuseofDNAarrays.Atright,aGeneChiprevealstheexpressionlevelsofmorethan12,000humangenes;

thebrightnessofeachspotindicatestheexpressionlevelofthecorrespondinggene.[（Left）RogerHart/Rainbow.（Right）GeneChipcourtesyofAffymetrix.]

例如从毛毛虫转变成蝴蝶的过程，涉及到基因表达模式的急剧变化。

数以千计的基因表达水平可以通过DNA阵列进行检测。

在右边，基因芯片发现超过12,000人的基因的表达水平，每个点的亮度显示相应的基因的表达水平。

罗杰·

哈特（左）/彩虹。

（右）Affymetrix公司的基因芯片。

6.1.TheBasicToolsofGeneExploration

6.1生物基因研究的基本工具

Therapidprogressinbiotechnologyindeeditsveryexistenceisaresultofarelativelyfewtechniques.

1.Restriction-enzymeanalysis.Restrictionenzymesareprecise,molecularscalpelsthatallowtheinvestigatortomanipulateDNAsegments.

2.Blottingtechniques.TheSouthernandNorthernblotsareusedtoseparateandcharacterizeDNAandRNA,respectively.TheWesternblot,whichusesantibodiestocharacterizeproteins,wasdescribedinSection4.3.4.

3.DNAsequencing.TheprecisenucleotidesequenceofamoleculeofDNAcanbedetermined.Sequencinghasyieldedawealthofinformationconcerninggenearchitecture,thecontrolofgeneexpression,andproteinstructure.

4.Solid-phasesynthesisofnucleicacids.Precisesequencesofnucleicacidscanbesynthesizeddenovoandusedtoidentifyoramplifyothernucleicacids.

5.Thepolymerasechainreaction（PCR）.ThepolymerasechainreactionleadstoabillionfoldamplificationofasegmentofDNA.OnemoleculeofDNAcanbeamplifiedtoquantitiesthatpermitcharacterizationandmanipulation.Thispowerfultechniqueisbeingusedtodetectpathogensandgeneticdiseases,todeterminethesourceofahairleftatthesceneofacrime,andtoresurrectgenesfromfossils.

Afinaltool,theuseofwhichwillbehighlightedinthenextchapter,isthecomputer.Withoutthecomputer,itwouldbeimpossibletocatalog,access,andcharacterizetheabundantinformation,especiallyDNAsequenceinformation,thatthetechniquesjustoutlinedarerapidlygenerating.

生物技术的快速进步（的确存在）的结果是一个相对较少的技术。

1限制向内切酶分析限制性内切酶是非常精确的，允许研究者来操作DNA片度的分子手术手术刀。

2印记技术Southern和Northern杂交是分别用来分离和鉴定DNA和RNA。

Western杂交法是利用抗体来建党蛋白质的。

我们在4.4.3已经描述过。

3DNA序列一个DNA分子的核苷酸序列可以被精确的确定。

测序已经获得了丰富的有关于基因结构，积阴德调控表达，以及蛋白质结构的信息。

4固定核苷酸序列的合成精确的核苷酸序列可以从头合成，可被用来鉴定的放大其他的核苷酸序列。

5PCR反应聚合酶链式反应可以使一个DNA片段发达百亿万倍。

一个分子中的DNA可以被放大到允许表征和操纵的数量。

这项强大的技术已经用于检测病原体、基因疾病、鉴定犯罪现场的头发以及从化石中复活的基因。

最后一个工具，电脑，将在下一章中突出的介绍，如果没有计算机，我们将无法对这么丰富的信息进行编目录、存取及特性表征，尤其是DNA序列信息技术的快速生成。

6.1.1.RestrictionEnzymesSplitDNAintoSpecificFragments

6.1.1限制性内切酶可以把DNA切割成特定的基因片段

Restrictionenzymes,alsocalledrestrictionendonucleases,recognizespecificbasesequencesindouble-helicalDNAandcleave,atspecificplaces,bothstrandsofaduplexcontainingtherecognizedsequences.Tobiochemists,theseexquisitelyprecisescalpelsaremarvelousgiftsofnature.Theyareindispensableforanalyzingchromosomestructure,sequencingverylongDNAmolecules,isolatinggenes,andcreatingnewDNAmoleculesthatcanbecloned.WernerArberandHamiltonSmithdiscoveredrestrictionenzymes,andDanielNathanspioneeredtheiruseinthelate1960s.

限制酶，又叫限制性内切酶，可以识别DNA双螺旋结构中的特定碱基序列，并且在包含有识别序列的两条链的在特定位点切割。

对生物化学家来说，这些精确灵巧的手术刀是自然界了不起的馈赠。

他们在分析染色体结构、长的DNA分子测序、分离基因以及创造新的DNA分子并克隆这些方面的作用都是不可替代的。

WernerArberandHamiltonSmith发现了限制性内切酶，而DanielNathans率先在20世纪60年代使用。

Restrictionenzymesarefoundinawidevarietyofprokaryotes.TheirbiologicalroleistocleaveforeignDNAmolecules.Thecell'

sownDNAisnotdegraded,becausethesitesrecognizedbyitsownrestrictionenzymesaremethylated.Manyrestrictionenzymesrecognizespecificsequencesoffourtoeightbasepairsandhydrolyzeaphosphodiesterbondineachstrandinthisregion.Astrikingcharacteristicofthesecleavagesitesisthattheyalmostalwayspossesstwofoldrotationalsymmetry.Inotherwords,therecognizedsequenceispalindromic,oraninvertedrepeat,andthecleavagesitesaresymmetricallypositioned.Forexample,thesequencerecognizedbyarestrictionenzymefromStreptomycesachromogenesis:

限制性内切酶在各种各样的原核生物中发现。

他们的生物学作用是切割外源DNA。

他们自身的的DNA不会被切割，原因是他们自身限制性内切酶的识别的DNA位点被甲基化了。

许多限制性内切酶的特定识别序列有4-8个碱基对，在这一区域，每条链上的磷酸二酯键发生水解。

这些切割位点具有一个非常显著的特点，即他们几乎都具有双重旋转对称。

话句话说，识别序列是回文结构，或者反向重复，切割位点是对称的位置。

列如，不产色链霉菌的限制性酶切位点如下：

回文结构：

一个字，句子或经文，不管是从右边读到左边还是从左边读到右边都是相同的。

Radar

Madam,I'

mAdam

AblewasIereIsawElba

Romatibisubitomotibusibitamor

Ineachstrand,theenzymecleavestheC-Gphosphodiesterbondonthe3sideofthesymmetryaxis.AsweshallseeinChapter9,thissymmetryreflectsthatofstructuresoftherestrictionenzymesthemselves.

在每条链中，酶切割C-G磷酸二酯键上的3侧的对称轴。

正如我们将要在第九章看到一样，这种对称性反映的限制性内切酶本身的结构。

Morethan100restrictionenzymeshavebeenpurifiedandcharacterized.Theirnamesconsistofathree-letterabbreviationforthehostorganism（e.g.,EcoforEscherichiacoli,HinforHaemophilusinfluenzae,HaeforHaemophilusaegyptius）followedbyastraindesignation（ifneeded）andaromannumeral（ifmorethanonerestrictionenzymefromthesamestrainhasbeenidentified）.ThespecificitiesofseveraloftheseenzymesareshowninFigure6.1.Notethatthecutsmaybestaggeredoreven.

已经有100多种限制性内切酶被纯化和鉴定。

它们的名字是由三种宿主细胞缩写而成的（列如Eco是大肠杆菌的缩写，Him是流感嗜血杆菌的缩写，Hae则来自埃及嗜血杆菌），紧跟着是指定的应变（如果需要的话）和罗马数字（如果超过一种限制性内切酶被鉴定存在于同一种菌株内）。

图6.1所示的是几种特异性酶，需要注意的是，切割可能会导致交错。

图6.1一些特异性的限制性酶切位点

包含有双重对称轴线的碱基序列被这些酶识别。

这个区域的两条链之间用一个180度旋转的通过一个绿色符号标记对称轴连接着。

酶切位点用红色的箭头标记。

每个限制性酶的简写再合适的序列位置被标记。

RestrictionenzymesareusedtocleaveDNAmoleculesintospecificfragmentsthataremorereadilyanalyzedandmanipulatedthantheentireparentmolecule.Forexample,the5.1-kbcircularduplexDNAofthetumor-producingSV40virusiscleavedat1sitebyEcoRI,4sitesbyHpaI,and11sitesbyHindIII.ApieceofDNAproducedbytheactionofonerestrictionenzymecanbespecificallycleavedintosmallerfragmentsbyanotherrestrictionenzyme.ThepatternofsuchfragmentscanserveasafingerprintofaDNAmolecule,aswillbediscussedshortly.Indeed,complexchromosomescontaininghundredsofmillionsofbasepairscanbemappedbyusingaseriesofrestrictionenzymes.

限制性内切酶被用于将DNA切割成特定的片段，这样便于分析，而且相对于整个DNA分子易操作。

列如，肿瘤产生的1.5kb的环状SV40病毒，被有1个位点的EcoRI、4个位点的HpaI以及11个位点Hind

限制性内切酶切割。

被一种限制性内切酶作用产生的一段DNA还可以被其他限制性内切酶切割成更小的片段。

这些样品可以作为DNA分子的指纹，这是不久就要讨论的。

的确，包括数以百万的碱基对组成的复杂的染色体，通过一系列的限制性内切酶使用，可以被描绘出来。

6.1.2.RestrictionFragmentsCanBeSeparatedbyGelElectrophoresisandVisualized

6.1.2通过凝胶电泳可以使限制性片段分离，并且可视化

SmalldifferencesbetweenrelatedDNAmoleculescanbereadilydetectedbecausetheirrestrictionfragmentscanbeseparatedanddisplayedbygelelectrophoresis.Inmanytypesofgels,theelectrophoreticmobilityofaDNAfragmentisinverselyproportionaltothelogarithmofthenumberofba