绝密简明基因工程原理Word格式文档下载.docx
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1）DNA样品的纯度：
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等；
加大酶的用量，1mgDNA用10U酶；
加大反应总体积；
延长反应时间
2）DNA样品的甲基化程度
识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性，因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌株
3）酶切消化反应的温度
4）DNA的分子结构
5）溶液中离子浓度及种类
6）缓冲液的PH值
15、限制性核酸内切酶的特点
1）识别位点的DNA序列具有回文结构；
2）切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端；
3）错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端；
16、限制性核酸内切酶的应用
1）在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片断；
2）用限制酶切割产生的相同粘末端以便重组；
3）建立DNA的限制酶切图谱；
4）构建基因组文库。
17、限制性酶切图谱：
指限制性内切核酸酶的特异切点在DNA上的定位，表现出一些部位的线性序列，它是DNA分子结构特性的反映，所以限制酶切图谱又称物理图谱。
18、DNA聚合酶
DNA聚合酶作用的特点：
（1）要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA；
（2）接受模板指导；
（3）需要有引物（3’羟基）的存在；
（4）不能起始合成新的DNA链；
（5）催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端；
（6）催化DNA的合成方向是5’—3’。
缺口平移：
5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进
19、常用的DNA聚合酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ
2、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶
3、T4DNA聚合酶
4、T7DNA聚合酶
5、反转录酶等。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
DNA聚合酶Ⅰ特点
活性：
5’3’聚合低
5’3’外切有
3’5’外切低
DNA聚合酶Ⅰ的功能：
（1）聚合作用；
（2）3’-5’外切——校对作用；
（3）5’-3’外切——切除修复作用；
（4）焦磷酸解作用；
（5）焦磷酸交换作用
二、Klenow片段
Klenow酶（大肠杆菌DNA聚合酶I大片段）：
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶
1、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段
5’3’聚合低
5’3’外切无！
2.Klenow片段的应用
用途：
（1）填充和补平限制性内切酶切割后产生的凹陷的3′末端
（2）标记DNA片段的末端
（3）催化cDNA第二链的合成（4）用于DNA的序列分析
（5）催化与单链配对的寡核苷酸引物的延伸，合成杂交探针
三.T4DNA聚合酶
1.T4DNA聚合酶特点
5’3’外切无
3’5’外切高！
取代反应
2.T4DNA聚合酶活性的条件:
模版、引物、原料dNTP
3.T4DNA聚合酶的用途：
不论是凸出的5′端还是3′端，只要满足高浓度dNTPs的要求，该酶都能将末端补平，使DNA便于与街头连接.;
可用于3′端凸出DNA的末端标记;
3′凹陷末端同位素标记
四.T7DNA聚合酶
1.T7DNA聚合酶特点
5’3’聚合高！
3’5’外切高
2.T7DNA聚合酶的应用
（1）用于拷贝长段模板的引物延伸反应；
（2）通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记
五、耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
1、酶活性与热稳定性2、离子依赖性3、忠实性4、抑制剂5、用途：
1）用于DNA测序2）用于聚合酶链反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增
六、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
TdT的基本用途：
1）给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾2）DNA片段3’末端的同位素标记
七、依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）
1、反转录酶的基本特性：
DNA聚合酶活性；
RNaseH活性；
DNA指导的DNA聚合酶活性；
有些反转录酶还有DNA内切酶活性
2、反转录酶的基本用途：
（1）将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库
（2）对具有5‘突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针
（3）代替Klenow片段，用于DNA序列测定
20、DNA连接酶
1）定义：
催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（1igase）
2）分类：
用于共价连接DNA片段的连接酶有两种不同的来源：
一种是由大肠杆菌染色体编码的DNA连接酶：
另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶。
这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸]作能源辅助因子，后者ATP[腺苷三磷酸]作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差别。
3）作用机理：
1、ATP（NAD+）提供激活的AMP。
2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。
3、AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。
4、AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。
5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。
4）DNA分子连接的四种形式
1.粘性末端；
2.平末端；
3.平末端加尾；
4.平末端加衔接物（linker）或接头（adaptor）
（1）DigestionandLigation
1．粘性末端连接
Problem:
（自我环化作用）
解决方法：
a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸
2.平末端连接
粘性末端连接效率高于平末端约100倍！
化平末端为粘性末端
3.平末端连接---同聚物加尾法
（1）末端脱氧核苷酸转移酶
功能：
5’至3’单链聚合
作用特点：
单链；
无模版
作用机理：
a:
用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸,获得3’-OH的单链延伸末端。
b:
加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly（dA）和poly（dT）组成的DNA单链延伸。
c:
获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。
缺点：
当poly（dA），Poly（dT）不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。
需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。
4.平末端连接
---衔接物连接法与接头连接法
（1）平末端的衔接物连接法
衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。
通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。
（2）平末端的接头连接法
将具有某种限制性酶（BamHI）粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。
21、S1核酸酶：
单链核酸内切酶
是一种特异性单链核苷酸外切酶，能讲解单链DNA和单链RNA，产生5‘单链核苷酸或寡核苷酸。
2）S1核酸酶的重要用途：
去除DNA片段的单链突端，使之成为平端；
去除cDNA合成时形成的发夹结构；
施行S1核酸酶保护实验，分析转录产物；
成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子；
修整渐进性删除突变的末端
22、Bal31核酸酶：
单链内切双链外切的核酸酶
Bal31核酸酶的基本用途：
用于不同长度的删除突变克隆实验；
绘制DNA限制性酶切图谱；
研究超螺旋DNA的二级结构和致畸剂引起的双链DNA螺旋结构的变化
23、碱性磷酸单酯酶
碱性磷酸单酯酶基本用途：
去除载体DNA5’端磷酸化，防止载体自身环化，减低本底，提高重组率；
去除DNA和RNA的5‘端磷酸基，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记
24、T4-多聚核苷酸激酶（T4-PNP）
1）T4-PNP的基本特性：
在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸
2）用途：
用于探针的末端同位素标记
第三章基因载体的选择与构建
一、基因克隆与基因重组
基因工程的基本过程是基因克隆，即获得含目的基因的重组体DNA的无性繁殖系。
基因重组是基因工程的核心。
所谓基因重组就是在获得目的基因之后，利用限制性内切酶和其他一些酶进行切割或修饰载体DNA的目的基因，将两者连接，使目的基因插入到可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，达到外源性目的基因在受体细胞内得到正确的表达。
基因重组包括①载体的选择和构建；
②载体DNA与目的基因连接这样两个主要工作内容。
二、基因载体
克隆载体（clonyvector）：
具有在细胞内进行自我复制的DNA分子，起运送目的基因到受体细胞的作用。
基因工程中的载体应具有如下一些特性：
1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。
在其DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。
2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。
3）在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点（最好是单一酶切位点）。
这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。
某些病毒载体在外源DNA插入后变成缺损性病毒株，只能在有辅助病毒存在时才能进行正常增殖。
4）具有能够观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。
三、载体的报告基因（标记基因）
基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。
这种具有标志意义的基因称为报告基因（reportergene），或标记基因。
报告基因通常是处于另一基因下游，并可反映转录及上游基因表达水平的基因。
四、细菌质粒载体
1．质粒的概念
细菌质粒（plasmid）是基因工程中最常用的载体。
质粒是细菌染色体外的小型环状双链的DNA分子。
一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构，就细胞生存而言，质粒能在细菌内独立自主地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
有些质粒可以组合在细菌染色体中，随着染色体复制，称为附加体（episome）。
质粒广泛存在于原核细胞。
2．质粒DNA的分子特性
1）常见的三种构型及分子质量：
共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型（closedcircleDNA，ccDNA），有时会因单链断裂而成为开链环状DNA（opencircleDNA，ocDNA）有时双链断开成线性DNA（linerDNA，IDNA）。
由于它们的空间构型不同，这三种DNA分子的电泳行为也不同。
根据这一特性，常用琼脂糖凝胶电泳将它们分开。
由于质粒DNA分子构型不同，它们与溴化乙锭结合能力也有差异，造成分子密度不同，可经氯化艳密度超离心，将三种不同构型的质粒DNA彼此之间或同染色体DNA、RNA分子区分开来。
这就是氦化铯密度梯度离心分离、纯化DNA的原理（图6.1）。
不同种类的质粒的分子最大小不一，小的2kb--3kb，大的可达数百kh。
2）能自主复制
3）对宿主生存并不是必需的
4）都有一个复制起始区和复制起点
5）有一套完整的复制调节结构
3.质粒的复制和遗传
按质粒复制与宿主菌的相关程度，可以把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒两类。
严密型质粒的复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1～2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止。
质粒在宿主菌内通常可含10～200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。
因此，通常选用松弛型质粒作为基因工程载体，以期在质粒插入外源基因后，可在子代细菌的重组质粒中获得高产量的目的基因。
些情况下，在大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能又是有害的，此时可使用严密型质粒来分离、纯化多拷贝的质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因。
对策：
使用严密型质粒来分离、纯化多拷贝的松弛质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因，也就是用松弛型质粒与严密型质粒杂交改良；
使用温度敏感性载体。
有的质粒带有一种tra基因，该基因产物促进质粒与细菌结合。
根据质粒是否带tra基因，质粒又可分了结合型和非结合型质粒。
4．质粒的报告基因
质粒的报告基因在DNA重组工作中具有重要意义。
因为质粒虽然不是细菌生长繁殖所必需的结构，但质料携带有某些遗传信息，所以质粒的存在会赋予宿主细胞一些遗传特征。
抗药性质粒（R因子）能使宿主细胞对某些抗生素或重金属的抗性；
F因子决定大肠杆菌的性别，故又称性因子。
F因子是一种附加体。
还有一些细菌因其标志基因产生细菌毒素，有的发酵糖和产生硫化氢，等等。
有些质粒不赋予或者尚不清楚它赋予宿主细胞何种表型，称为隐性质粒。
通过质粒的标志基因的表达，可使宿主菌呈现一些可观察到的细胞生物学特征。
通过质粒赋予细胞的表型可以识别和筛选重组体DNA的转化子细菌。
基因工程操作中以质粒作载体时，质粒的报告基因中最有应用价值的是抗药性基因，如抗氨茉青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素或新霉素等抗生素抗性基因。
利用这些遗传标志，可用来证明载体已经进入宿主细胞，可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中挑选出来。
α-互补：
LacZ（半乳糖苷酶）有两个主要的亚基，α亚基和ω亚基，前者的DNA序列很短，后者比较长。
α与ω相结合就能表现出半乳糖苷酶活性。
所以大部分基因工程菌株的基因组上都有ω亚基的序列，但是敲除了α亚基序列，默认只表达ω亚基，不会有半乳糖苷酶活性。
但是如果转化的质粒上有连续完整的α亚基序列，那么就会表达α亚基，产生“α互补”，表现出LacZ活性。
LacZ活性可以用蓝白斑筛选等办法检测，有此活性通常说明MCS区域没有插入需要的片断，α亚基序列仍然保持完整、连续；
反之则α亚基序列的连续性被破坏，MCS区域已经插入东西。
蓝白斑筛选：
利用β-半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物（X-gal）和诱导物（1PTG）存在时，可形成深蓝色菌斑。
用这种载体进行克隆时，β-半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代，所产生的重组体丧失α-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑。
因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。
5.质粒的转座子
在质粒的遗传问题中，还存在转座或易位（transposi-tion）现象。
转座子，又叫易位子（tronoposon）是质粒上一段特定的DNA序列，这段序列能从所在的质粒易位至另一质粒或染色体。
如抗氨苄青霉素基因（ampr）、抗四环素基因（tetr）抗卡那霉素基因（banr）等等标志基因，都是易位子。
易位子易位给另一复制子后，还可再次易位。
6．质粒的相容性
质粒的不相容性：
是指两种不同的质粒不能共存于同一寄主细胞中，也就是说，如果细菌体内已存在着一类质粒，那么它排斥互不相容的质粒进入细胞。
克服方法：
寻找与构建相容质粒和穿梭质粒。
7．质粒的改造
分配结构：
有一段DNA与稳定传代有关，具有是复制质粒分配到细胞分裂后子细胞中去的能力，这段DNA叫做分配结构。
8．质粒载体的条件
理想的细菌质粒载体，除与其他类型载体相同的特点外，还应具备以下条件：
1）分子量尽可能小，多拷贝，而且便于提取和纯化。
2）缺失流动基因（mob）。
这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌。
3）DNA结构和功能清楚。
质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点，在插入外源基因后，不影响质粒自身复制。
现在的质粒一般有多克隆位点。
4）插入外源基因的重组质粒，较易导人宿主菌内复制和表达。
5）具有一个或几个报告基因，而且限制性内切酶的单切点恰好在此基因之内，由于插入外源基因，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。
9，质粒载体的多克隆位点
现在几乎所有的基因工程载体都含有一个人工合成的密集排列的系列多克隆位点，称为载体多克隆位点，或称多接头或称限制性酶切位点库，由常用的限制性内切酶所能识别的序列组成。
10．常用的质粒载体
11.质粒DNA的提取
①细菌培养物的生长：
从琼脂平板上挑取一个菌落，接种在培养基如含有适当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒。
pUC系列，不必选择性扩增质粒DNA。
pBR322，需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，其拷贝数持续递增。
②细菌的收获和裂解：
由离心法收获细菌。
裂解常用非离子或离子型去污剂、有机溶剂或碱、加热处理、酸酚法等等。
裂解（变性）抽提法常用，经济且收得率高，提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化，但可因操作不慎会影响纯度，操作较繁。
碱变性抽提的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在pH高达12．6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当以pH4．8的NaAC高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀而除去，因而提取到质粒DNA。
SDS是离子型表面活性剂，它的功能是：
溶解细胞膜上的脂肪及与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；
解聚细胞中的核蛋白；
与蛋白质结合成为R1-O-SO3-...R2+蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，否则残留SDS会干扰用RNase去除RNA时的操作。
③质粒DNA纯化：
利用质粒DNA相对较小及共价闭合环状这两个性质。
具体方法有氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心、离子交层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等。
④质粒DNA保存；
用RNase来去除溶液中的RNA，再用SDS与KAC处理后，质粒DNA溶于TE溶液中低温保存。
磷酸缓冲液和硼酸系统等虽然也符合细胞内环境的生理范围（pH），可作DNA保存液，但在作转化实验时，磷酸根离子与Ca2+可产生Ca3（PO4）2沉淀；
在DNA酶反应时，不同酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离于浓度，有的则要求低盐浓底，采用Tris－HCI（pH=8）的缓冲液，由于缓冲对是TrisH+／Tris，不存在金属离子的干扰，放在提取或保存DNA时，大都采用Tris－HCI缓系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
五、噬菌体载体
1.噬菌体和噬菌体载体的特点
噬菌体是寄生在细菌中的病毒，故又称细菌病毒。
噬菌体由蛋白质构成的正二十面体头部和中空的尾部组成，在其头部的蛋白质外壳中含有DNA。
噬菌体的种类：
λ噬菌体、单链噬菌体载体、粘性质粒载体。
除含大基因的λ和T噬菌体外，还有一组小分子丝状噬菌体，如M13等均可改造成为重组DNA的载体。
2.λ噬菌体
λ噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿主菌大肠杆菌后，呈现溶菌性和溶源性两类生长方式。
其基因组分为几个不连续的区域，这对基因工程构建噬菌体载体十分有用．每个噬菌体DNA由三个片段组成：
（1）左臂，19．6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，A～J的12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中A～E5个基因与头部形成有关，G～J5个基因与尾部形成有关。
（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。
（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。
与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。
噬菌体左右两臂包含了太复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。
λ噬菌体DNA的两个5‘端为12bp的单链，两端序列互补成为天然的“粘性末端”。
λ噬菌体DNA进入宿主菌体后，通过两个末端互补结合而形成粘性末端位（cohesive-endsite，简称cos位点）整个DNA分子环化。
3．溶菌性反应与溶源性反应
溶菌性方式（lyticpathway）：
在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。
②溶原性方式（lysogenicpathway）：
进入细菌的λDNA可整合（integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体（prophage），含有原噬菌体的细菌称为溶源菌（lys
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