21微生物的染色及观察.docx

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21微生物的染色及观察

2.1微生物的染色及观察

—、染色的基本原理

•借助细胞对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等物理因素和细胞与染料发生化学反应而进行的

•细菌等电点较低，pH值人约在2・5之间，故在中性、碱件或弱酸性溶液中，菌体蛋门质电离肩带阴电荷：

而碱性染料电离时染料离子带阳电。

因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。

所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。

二、染料的种类和选择

染料分为天然染料和人工染料两种。

人然染料冇胭脂虫红、地衣素、石戏和苏木索等。

目刑主婆采用人工染料，幺从煤焦油中捉取获得，是苯的衍生物.多数染料为难溶于水.而易溶于冇机溶剂中。

为使它们易溶于水.通常制成盐类。

染料可按其电离后染料离了•所帶电荷的件质.分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类.

1、酸性染料

这类染料电离頤染料离f带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味和酸性复红等，町与碱性物质纳合成盐。

X培养基肉椭炎分解产酸便dHTi下降时，细苗所带的正电荷增加，这时选抒酸性染料，易被染色。

2、碱性染料

这类染料电离厉染料离子带正电，可与酸件物质结合成盐.微牛物实验牢一般常用的緘件染村仃美兰、甲基紫、结晶紫、祓性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的常况F.细苗易被碱性染料染色。

3、中性（复合）染料

酸性染料与碱性染料的结合物叫做屮性（复合）染料,如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等,后者常用于细胞核的染色。

4、单纯染料

这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质牛成盐,其染色能力视其是否溶丁•被染物而定，因为它们人多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶丁•脂肪溶剂屮，如紫丹类（Sudanb）的染料。

三、染色

微生物染色分为单染法和复染法两种。

前咅用•种染料使微牛物染色，但不能鑒别微生物。

以染法是用两种或两种以匕染料，有吟别微生物作用。

常用复染浓何革兰氏染色沐和抗酸性染色法以及特殊染色法（如芽胞、鞭毛、细胞核等）。

仅品微生物检验中常用的兄单染色法和革兰氏染色法。

1、单染色法

用一种染色剂对涂片进行染色，简使易行，适于进行微生物的形态观察。

在-•般怙况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而彼染色。

因此，常用碱件染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。

注：

若便用酸性染料，多用刚果虹、伊红、藻红和酸性品红等・使用酸性染料时，必须降低染液的PH值.便其呈现強酸件（低于细瀚*1体等电点八让繭体带匸电荷.才易r彼酸性染料染色.

单染色法过程：

（1）制片

在干净的载玻片上滴上一小滴蒸啊水，用接种环进行无菌操作，挑収培养物少许，置水滴小，9水混介做成总液并涂成直径约1丿里米的洒层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，町在载玻片•侧再加滴水.从已涂布的闔液中再取-环于此水滴中进行稀释.涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗卜制备的菌液，则直接涂布丁谶玻片上即可。

（2）自然十燥水或窗液

涂片最好在宰温卜•使其□然卡燥，为了干得快些，町将标本面向上，乎持坡玻片诩小心在酒粘灯高处微微加热，便水分蒸发，但切勿紧雒火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

（3）固定

•固迟的目的：

1）杀死微牛物，固泄细胞结构。

2）保证菌体fil勺粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗織

3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的易r染色。

•方法:

利用■温.手执伐玻片的•端.标本向出在酒稍灯火焰外圧尽快的來冋通过3・4次，共约2・3秒钟，并不时以载:

吸片笛而加热触及皮肤.不觉过烫为宜（不超过60C），放直待冷后进行染色。

•注：

在研究微牛物细胞结构时应采用化学固定法。

化学固定法常用的固定剂：

酒粘（95%）、酒帖和醴备半的混合物、丙刖、1-2%饿酸等。

饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。

•饿酸固运细胞的技术：

在菇养皿中放一玻頊.在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1-2%饿酸溶液，同时A」皮璃上再放*湿标本涂片的载玻片.然后把培养血盖匕经过1・2分仲后•把标本从培养皿中取出干燥。

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（4）染色：

标本固定后，滴加染色液，约1・3分钟。

;i：

整个涂片（或有标本的部分）2浸在染稻脚％

单染色过稈：

涂片固定染水洗干燥

染色液

染色结果

特点

石碳酸复红

繭体呈红色

着色快，时间短

美兰

菌体呈兰色

着色慢，时间长，效果清晰

草酸彼

菌体呈紫色

染色迅速，着色深

2、复染色法（革兰氏染色法）

（1）革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上自很多差别，染色反应不一样.现在-般i人为革兰氏阳性苗休内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这足染色反应的主要依据。

（2）阳件菌菌体等电点较阴性菌为低.在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。

所以染色时的条件要严格控制。

例如：

在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都町呈正反应：

PH很低时，则町都呈负反应。

（3）两类胡的细胞權等对结品紫-碘复合物的通透件也不一致，阳牲菌透性小,故不易被脱色,阴性歯透性人,易脱色。

所以脱色时间,脱色方法也应严格控制。

过程:

V——燥一定——染（见前）

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（3）复染

脱色后再用•种染色剂进行染色.勺不披说色部位形成鲜明的对照，便「•观察・隹氏染色在洒精脱色后用番红垠后进彳」••染色，就足复染。

（5）丁燥

若色标本洗净后.将标本晾干.或用吸水纸把多余的水吸去,然后晾干或微热烘干.用吸水纸时.切勿将閑体擦掉。

革兰氏染色法