分子生物学文献翻译作业文档格式.docx

分子生物学文献翻译作业文档格式.docx

《分子生物学文献翻译作业文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学文献翻译作业文档格式.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

焦虑症终生患病率上升，但尚缺乏有效减轻长期创伤记忆的方法。

基于记忆更新机制，唤醒记忆的过程是减轻近期记忆（即日龄）损伤最有效的治疗方法。

我们研究发现在小鼠中，对于近期记忆再现适用的整理更新模式却并不适用于远程（即月龄）记忆。

我们发现，海马神经可塑性参与再现近期记忆，其中一部分是人组蛋白脱乙酰化酶（HDAC2）亚硝基化和组蛋白乙酰化参与的，但却并未在远期记忆中发现。

然而，在记忆重整过程中加入HDAC2靶向抑制剂（HDACi）时，我们发现，即使是很久之前的记忆也会发生持续减弱。

这种表观遗传学上的干预后产生的神经再塑相关的基因，伴随着较高的代谢、较多突触以及结构可塑性。

因此，在记忆巩固过程中，应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂可能成为修复远程创伤的方法。

引言

在经历了类如严重的身体或心理伤害的创伤性事件之后，人们会罹患恐惧和其他焦虑症。

研究表明人们约29%终生患病率，并且由于存在强烈的情感基础而使得创伤记忆非常强大，难以治疗。

焦虑症的治疗方法中，最有效的是暴露疗法，即将患者置于安全的环境中，在这期间重复给予最初引起恐惧的刺激，从而使得最初的恐惧刺激变成中性或安全的刺激。

成功的暴露疗法的基本要求是创伤记忆的激活，在有限的时间内记忆变得易于修改即记忆再巩固过程。

在暴露疗法中，已证明再巩固更新方法是能够减轻人类和啮齿类动物对可怕的刺激的反应有效的方法，类似的方法已成功地用于预防药物依赖和再发。

基于在记忆巩固过程中存在一段时间的更新和学习的假设，人们在做药理学研究来论证该说法。

其中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACis）可能在永久修复恐惧记忆上有很大的应用前景，有两个原因。

首先，通过改变染色紧凑性，表观遗传机制对基因表达可能存在稳定而持久的影响，这是长期记忆所需的特征理；

第二，表观遗传机制可能参与一系列与神经元可塑性有关的核过程，这样，他们的影响便不仅仅被限制于一个特定的信号传导通路中。

值得注意的是，能够减轻恐惧反应的单纯的行为学或药理学的方法几乎都集中在近期记忆，即日龄，使得尚不能明确其是否对远程记忆，即月龄，起作用。

创伤性记忆往往不容易被直接处理，由于远期记忆比近期记忆更稳定，因此亟待一个明确的关于克服远期对于恐惧记忆的方法。

结果

尽管使用整理更新模式，远程的记忆不能持续衰减

为了测试基于暴露疗法是否能够被用来减轻远期创伤记忆，我们采用巴甫洛夫恐惧调节小鼠，这种方法常用于研究恐惧反应，如创伤后应激障碍（PTSD）。

在恐惧条件反射中，同时给予非条件刺激（US）-----电击，和条件刺激（CS）-----特定的音调或语境下的提示性的、语境性的恐惧调节。

当测定动物被暴露在条件刺激下所产生的恐惧时，产生了类似空调的反应（CR），冻结。

具体来说，我们训练小鼠在线索性的或情境性的恐惧调节，在1天和30天之后，我们试图通过不同的恐惧消退模式来减弱小鼠的类空调反应。

所有这些模式利用瞬时不稳定记忆以及出现1和6小时后的记忆重现稳固窗。

第一个研究运用针对于线索性恐惧调节的集中灭绝模式，来减弱条件性刺激如音调所引起的类空调反应（CR）。

我们发现，对于近期记忆，这种模式能够即刻持续减弱类空调反应，并在1天后消退。

重要的是，研究并没有发现恐惧自发恢复（SR）或恢复（RI）的迹象，代表着恐惧的不完全消退。

我们对比发现，在远期记忆中，虽然这种模式能够有效减弱冻结反应，在灭绝之后，但仍有明显的RI和SR的迹象表明原始记忆的存在。

这一发现和远期记忆的自发恢复和恢复是想一致的，并没有再现记忆。

第二个研究运用针对于情景性的恐惧调节的集中灭绝模式，来减弱条件性刺激如音调所引起的类空调反应（CR）。

通过使用这种模式，近期恐惧记忆成功地并永久地衰减，但远期恐惧记忆明显有恢复的迹象。

在没有回忆是也得到了相似的结果。

此外，研究发现越来越多的间断性间隔消退训练能够促进恐惧记忆消退，因此我们推断这样的间距训练也有助于减弱远期恐惧记忆。

这一模式显著减弱近期恐惧记忆，并没有任何SR的迹象。

然而，当运用到远期记忆时，同样的模式甚至不能暂时性的减少恐惧，当测试SR时，冻结症状的水平和再唤醒记忆相似。

在没有再现记忆的条件下同样得到类似结果。

同样，这些结果表明，三种不同的行为模式，能够使近期恐惧记忆消退，但却并不能使远期恐惧记忆消退，尽管考虑到有记忆再现引起的瞬时不稳定记忆。

问题就在于为什么远期恐惧记忆更难以消退。

回忆远期记忆不足以诱导组蛋白乙酰化介导的海马神经元可塑性

根据定义，再现记忆开启再巩固记忆之窗，其允许更新之前的记忆，因此产生一段新时期的神经可塑性。

我们推测，近期记忆和远期记忆的记忆再现存在不同程度的神经可塑性。

在随后的分析中，我们专注于研究情景性的恐惧记忆，其形成依赖于海马，它是大脑里与记忆相关的神经元可塑性非常重要的区域，激活了远期记忆再现。

调控神经可塑性的一个基本机制是组蛋白乙酰化修饰基因的表达。

组蛋白乙酰化改变了染色质结构，更改基因转录，从而正向调节依赖转录的持久神经可塑性。

为了测试相同的记忆在近期和远期记忆中是否存在不同的组蛋白乙酰化的差异，我们首先采用免疫组化分析来评估组蛋白乙酰化3赖氨酸残基9和14（H3K9/14），可促进神经可塑性。

我们发现，1小时后记忆再现，远期记忆中海马H3K9/14乙酰化是与行为学上的自然动物没有什么区别，但近期记忆明显变小。

接下来，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP），确定了H3K9/14乙酰化存在于CFO启动子区，即参与调控神经元的活动的早期基因，并且是神经可塑性的关键。

与整体组蛋白乙酰化模式相一致，我们发现远期记忆比近期记忆对相比CFO启动子去乙酰化作用刺激更大。

因此，CFO启动子区的表达在远期记忆后明显下降，前期的报道中也在蛋白水平发现与CFO相关的阳性细胞数量变化。

组蛋白乙酰化水平的增加依赖于神经元的活动，我们在体外培养中发现神经通道，其中组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）与染色体cys262和cys274发生亚硝基化相关。

因此我们研究了远期记忆中并没有发现组蛋白乙酰化增加可能是由海马中HDAC2亚硝基化不足引起的。

我们发现，当用生物素开关调控近期记忆时，30到60分钟后，HDAC2维持亚硝基状态不超过6小时。

因此，在记忆再巩固窗中，HDAC2亚硝基化参与限定时间点的记忆不稳定期。

相反，我们并没有发现远程记忆中的HDAC2亚硝基增加。

与亚硝基化状态一致，CFO中的启动子HDAC2的结合力下降，再现远期记忆时染色体上仍有HDAC2。

重要的是，引起上述改变时再现记忆是必要的。

所有这些结果表明，和近期记忆相比，远期记忆未能引起海马中HDAC2亚硝基化和组蛋白乙酰化介导的神经可塑性。

海马中HDAC2亚硝基化是再巩固更新记忆的关键

为了进一步评估神经可塑性中HDAC2亚硝基化作用，在近期记忆再现和消退训练之前，我们给予条件性恐惧小鼠左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME），是一种一氧化氮（NO）抑制剂合酶。

原因可能是其抑制作用将阻止亚硝基化对近期记忆的更新作用。

同时我们还发现，动物经记忆消退训练后给予L-NAME明显表现出恐惧衰减消退，却再发恐惧。

相比之下，被给予VEH治疗的没有复发的迹象。

L-NAME治疗不影响动物的行为。

有趣的是，研究发现给予L-NAME的动物，1小时后并没有HDAC2亚硝基化，其表明HDAC2亚硝基化是记忆巩固更新再现的关键。

然后，为了证明HDAC2亚硝基化参与记忆更新，我们进行如下实验步骤。

在远期记忆时给予小鼠一氧化氮氧化物MOL，其甚至可促进远期记忆更新，同时促进HDAC2非硝基化作用的过表达，双丙氨酸突变HDAC2C262/274A，其中MOL阻止远期记忆更新。

为此，在远期记忆再现2天前，我们向动物海马CA1区注入携带有HDAC2WTorHDAC2C262/274A的短期的单纯疱疹病毒（HSV）载体，以确保最大程度的记忆再现。

然后，记忆再现和消退训练1小时之前，我们向两实验组中给予MOL或其变体。

研究发现，远期记忆再现2小时候，MOL促进携带有HDAC2WT的短期的单纯疱疹病毒（HSV）载体的小鼠HDAC2亚硝基化，但并未发现其可促进携带有HDAC2C262/274A的短期的单纯疱疹病毒（HSV）载体的小鼠HDAC2亚硝基化亚硝基化，HDAC2周期性出现非亚硝基化形式。

当测量恐惧消退时，MOL治疗携带有HSV-HDAC2WT的动物表现出在记忆消退后明显的恐惧下降，也未见复发的迹象，表明一氧化氮参与记忆更新。

相比之下，MOL治疗携带有HDAC2C262/274A短期注射的动物明显表现出复发的迹象，尽管该动物已经历1天后的记忆消退训练并发生即刻记忆消退。

重要的是，MOL治疗并没有影响动物的一般行为。

这些结果表明，HDAC2亚硝基参与的远期记忆再现是有效地巩固更新记忆的关键。

HDAC2靶向抑制剂可以减弱远期恐惧记忆

因为MOL不仅仅作用于HDAC2，我们假设，通过使用HDAC2靶向抑制剂，或许还可以或许可以解决远期记忆中神经可塑性相关的蛋白乙酰化缺乏的问题，从而改善记忆更新机制。

为此，我们采用基于苯甲酰胺的HDACiCI994，是一种选择性抑制剂HDACs，包括HDAC2。

全身，按每公斤30毫克持久（T1/2=3.7小时）腹腔注射高浓度（Cmax=12.3毫米）CI-994，未影响整体行为。

为了在记忆巩固期成功的启动再更新机制，我们向受到条件性恐惧刺激的动物注射CI-994或其变体VEH，在再现记忆1小时后，然后采用上文提及的记忆消退训练。

对于大群的消退训练后，我们发现，VEH治疗的动物表现出明显的复发，而CI-994并没有该迹象。

此外，依赖于HDACi的记忆再现时，恐惧衰减效应的有所下降，当HDACi未给予再现刺激是，我们也观察到复发的迹象。

其次，给予间隔消退训练后，在给予CI-994的小鼠中，我们明显观察到CR减少，表明记忆再消退。

更重要的是，我们并未观察到SR，表明持续记忆消退，该效应参与记忆再现。

值得注意的是，我们在观HDACi缓解远期恐惧记忆上收获到同样的效果。

重要的是，HDACi并不会引起恐惧消退。

当同时给予小鼠线索性以及情景性的条件性恐惧刺激时，我们仅在给予情景刺激的小鼠中发现记忆消退（利用空间消退训练），其之后仍可观察到线索性恐惧记忆再现。

所有这些结果表明，在记忆巩固窗同时给予HDACi和记忆消退训练时，甚至可以缓解远期记忆。

HDAC抑制剂可促进海马转录后生成物，恢复神经元的可塑性

接下来，我们研究了HDACi的作用机制，假设消退训练结合CI-994可以增加组蛋白乙酰化介导的神经元可塑性。

我们研究间隔的消退记忆模式，因为该模式是当给予VEH和CI-1994不同的治疗时，动物将在记忆消退后表现不同的恐惧反应。

在动物记忆消退训练1小时后，首先用免疫组织化学法测定海马组蛋白乙酰化。

我们发现，和给予VEH治疗后发生组蛋白乙酰化的动物，在1小时后再现远期记忆时，相比，给予CI-994治疗的的动物明显有更高的乙酰化水平。

这和在海马中通过HDACi治疗减少HDAC2活性后的结果是一致的。

在前额叶皮质，远期记忆最开始存储在这里，消退训练结合CI-1994治疗后发生组蛋白乙酰化，与VEH治疗后的动物相比，或者与普通水平相比，在再现远期记忆1小时后，可观察到同样有所提升，这些可能表明HDACi治疗后皮质区的持续参与。

在下文的分析中，我们仍然专注于海马，因为该大脑区域在情景记忆再巩固时，在纳入新信息时是非常重要的。

除了组蛋白乙酰化，与神经可塑性相关的另一重要方面是与突触可塑性、学习及记忆相关的基因转录。

为了探讨这些，我们对同时给予VEH和CI-1994治疗的动物，在其完全记忆消退训练一小时后，海马区进行RNA测序。

在表达倍数变化截止到1.4倍的时候，我们发现了在CI-1994和VEH处理的动物之间，存在475个差异表达基因（DEGS），其中有199个基因在CI-1994处理的动物有较高的表达。

在通路和基因分析中，我们注意到这些在生物学进程的差异与神经元可塑性相关，如学习、记忆、神经冲动的调节、细胞形态、阳离子转运及突触传递。

这些研究结果表明，CI-1994治疗结合记忆消退训练，神经元可塑性在基因表达水平得到提高。

此外，我们发现神经元可塑性相关的几个关节调节因子，在CI-1994治疗的动物中有明显的上升。

这些基因包括早期基因Arc和cFos，其都参突触可塑性和记忆有关的过程，Adcy6，是一种可以调节神经突起的腺苷酸环化酶，Npas4，一种调节情景性记忆的转录因子，lgf2，可促进记忆保存和近期恐惧记忆消退。

利用qRT-PCR单独分析仅给予CI-994和VEH处理的动物后证实了这些基因表达变化。

重要的是，当仅给予HDACi而没有记忆消退训时，并没有发现上述基因变化，考虑到HDACi单独作用并不会影响行为。

具有高表达的基因在启动子区域中也表现出较高的乙酰化状态。

有趣的是，在启动子上给予HDAC2时也可观察到组蛋白乙酰化增加。

这些调查结果表明，远期记忆再现后给予HDACi治疗后能够弥补HDAC2亚硝基化缺失及其持续性与染色质结合，从而提高了在基因表达水平的组蛋白乙酰化介导的神经可塑性。

抑制剂可在记忆消退中增加神经可塑性

最后，我们进行了一系列的实验来评估神经可塑性相关基因的表达能否促进突触可塑性。

在1小时完全远期记忆消退后，我们首先利用2-脱氧葡萄糖吸收标记（3小时）测量了海马葡萄糖，其反映神经元活动性。

我们发现，CI-994治疗的动物表现出较高的海马3小时2-DG摄取率，相较于VEH治疗的动物，表明在记忆消退后大脑该区域代谢增加。

相比之下，VEH和CI-1994治疗的动物行3小时2-DG摄取率测量时，在大脑梨状皮质间并没有什么区别，该大脑区域牵连嗅觉记忆，从而并未与情境性记忆相联系。

接下来，为了测试这样的代谢活性的增加是否表明神经元可塑性增加，我们评估了谢弗病电生理长时程增强（LTP），在同一时刻记录。

利用三节律刺激（33TBS），我们观察到，表明和VEH相比，CI-994治疗的动物更能促进LTP。

同时，我们在基础突触传递中也并未发现区别，因为兴奋性突触后电位（fEPSP）速率由给定的突触前纤维诱发在两组间并无区别。

同样，我们在刺激配对脉冲方面并无发现明显差异。

这些结果表明，记忆消退训练结合CI-994增加海马突触可塑性。

最后，我们调查增加突触可塑性是否也可能增加结构可塑性。

对于这一点，我们通过微管关联D蛋白2（MAP2）免疫组化测量树突的数量，树突分支、高尔基染色树突棘和突触的密度，通过透射电子显微镜和突触免疫组织化学，即记忆消退后1小时的突触前标记。

这些测量反映了神经元的连接程度及突触强度。

我们发现，在海马的辐射层层面，和VEH治疗的动物相比，CI-994治疗的动物显示MAP2染色树突数量升高。

同样，我们用Sholl方法分析发现胞体树突分支120和170毫米不等，以及用CI-994治疗的动物也发现大数量的脊柱量；

值得注意的是，在分析脊柱的结构时，在HDACi-治疗的动物中，我们发现到蘑菇状脊柱多于瘦弱状的脊柱，其实脊柱成熟的标志。

最后，在CI-994处理后，功能性突触的密度也明显增加。

总之，我们的研究结果表明，除了表观遗传学上与基因表达方面可增加神经可塑性，同时，HDACi治疗的动物也同时表明突触数量及结构可塑性增加。

讨论

据报道，本篇研究是动物创伤记忆模型中减少远期记忆反应的第一篇成功报道。

之前的研究也表明，通过采用不同的行为模型，尽管再巩固更新模式中发现近期恐惧记忆消退，但并未发现远期恐惧记忆消退。

单独行为干预治愈能减少远期记忆弹性回复，其可能的机制是远期记忆组蛋白乙酰化介导的海马神经可塑性缺乏。

再现近期记忆与组蛋白乙酰化和神经元可塑性相关的基因表达，比如cFos，有关，其通过刺激HDAC2亚硝基化和其随后的染色质解离，而再现远期记忆未表现出来。

有趣的是，学习伴随着海马区NO信号增加，而小鼠缺乏神经元一氧化氮合酶（nNOS），表明其缺乏情境性恐惧记忆。

因此，根据尚未确定的机制，与HDAC2相关的海马NO信号下降可能阻止阶段性学习，其实远期记忆更新的关键。

虽然我们的分子学分析主要集中在海马，我们不排除在其他脑区，如杏仁核和皮质区，存在远期记忆衰减。

后者的大脑区域值得进一步研究，因为它被广泛承认，作为成熟的记忆元素，其显示在皮质区。

海马区神经可塑性远期记忆的缺乏，其表明海马区远期记忆缺乏。

然而，再现记忆依赖于皮质区远程记忆，再现了海马依赖性，并且人为地抑制海马的活动（在CA1区），在记忆再现方面，减少了远期记忆再现的能力。

目前的研究扩展了上述研究，其表明再现远期恐惧记忆合并记忆消退训练，并不能提高神经元可塑性水平，其在恐惧记忆更新方面是必须的。

相反，它联合使用HDAC靶向组蛋白去乙酰化酶抑制剂和记忆消退训练，可恢复海马区神经可塑性，并能更新远期创伤记忆。

在人类磁共振成像的研究中显示，持续的创伤性记忆的受试者显示较低的海马激活再现记忆活性，和那些成功进行恐惧记忆消退训练相比。

我们发现HDACI处理是触发神经可塑性相关基因上调的关键，伴随着各启动子区域组蛋白乙酰化增加。

这一观察结果表明HDACi可以在表观遗传学上将促使染色质转录可行，从而增强神经可塑性。

基因的表达增加表明远期记忆消退，同时也发现远期恐惧记忆消退时cFos、Arc以及Igf2表达增加，结论性证据表明至少对于近期恐惧记忆恐惧记忆，海马区IGF2在情境性记忆消退时必须的。

然而，与远期记忆相关的基因的作用仍待进一步探讨。

前期也有研究在近期记忆消退中使用HDACis。

有趣的是，在记忆巩固窗使用记忆消退模式的研究中，其本身就足以成功地减轻恐惧记忆。

再联系我们的实验，即HDACi成功参与近期记忆巩固更新机制的研究，并未引起进一步恐惧下降，这似乎表明HDACi能够促进那些单独给予记忆消退训练并未起作用的动物发生作用。

参与的记忆消退训练可结构和功能水平增加神经可塑性。

例如，我们观察到海马的代谢活动和LTP得到增强。

这与人类的功能磁共振成像研究相一致，这表明成功的记忆消退与海马高活性相关。

在结构水平上，我们发现记忆消退结合HDAC抑制剂治疗，能够增加突触密度以及树突分支和树突棘数量。

这些结果与最近一份关于脊柱数量的近期记忆消退训练报道相一致，表明单独的HDACi治疗可促进脊椎支数增加。

因此，这里所说的结构的变化是最有可能是由于记忆消退训练结合HDACi治疗的作用。

推而广之，我们发现了再塑神经可塑性支持记忆消退时一段新的学习期。

这种学习被认为是构成恐惧或是原始记忆痕迹，情景记忆与情景安全性结合起来。

有人认为，如果是前者，原始恐惧记忆将长期存在，继而SR、RI或重建，当CS表现在情境性记忆时。

基于这些纯粹的行为结果和发现，在再现记忆缺失时给予HDACi治疗时对行为表现无作用，因此我们的研究结果将不仅永久恐惧衰减反应，而且也是最开始被修改的记忆。

EpigeneticPrimingofMemoryUpdatingduringReconsolidationtoAttenuateRemoteFearMemories

SUMMARY

Traumaticeventsgeneratesomeofthemostenduringformsofmemories.Despitetheelevatedlifetimeprevalenceofanxietydisorders,effectivestrategiestoattenuatelong-termtraumaticmemoriesarescarce.Themostefficacioustreatmentstodiminishrecent（i.e.,day-old）traumatacapitalizeonmemoryupdatingmechanismsduringreconsolidationthatareinitiateduponmemoryrecall.Here,weshowthat,inmice,successfulreconsolidation-updatingparadigmsforrecentmemoriesfailtoattenuateremote（i.e.,month-old）ones.Wefindthat,whereasrecentmemoryrecallinducesalimitedperiodofhippocampalneuroplasticitymediated,inpart,byS-nitrosylationofHDAC2andhistoneacetylation,suchplasticityisabsentforremotememories.However,byusinganHDAC2-targetinginhibitor（HDACi）duringreconsolidation,evenremotememoriescanbepersistentlyattenuated.Thisinterventionepigeneticallyprimestheexpressionofneuroplasticityrelatedgenes,whichisaccompaniedbyhighermetabolic,synaptic,andstructuralplasticity.Thus,applyingHDACisduringmemoryreconsolidationmightconstituteatreatmentoptionforremotetraumata.

INTRODUCTION

Fearandotheranxietydisordersdevelopaftertheexperienceofatraumaticeventsuchasgravephysicalorpsychologicalharm.Becauseofastrongemotionalunderpinning,traumaticmemoriesareextraordinarilyrobustanddifficulttotreat,evidencedbyanestimatedlifetimeprevalenceofcloseto29%（Kessleretal.,2005）.Amongthemostefficacioustreatmentsforanxietydisordersareexposure-basedtherapies,duringwhichapatientisrepeatedlyconfrontedwiththeoriginalfear-elicitingstimulusinasafeenvironmentsothattheoncefearfulstimuluscanbenewlyinterpretedasneutralors