治疗性单克隆抗体类制品质量控制标准的思考张峰概要文档格式.docx
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治疗性单克隆抗体的质量控制。
E-mail:
zhf5122@
治疗性单克隆抗体类制品质量控制标准的思考
张峰综述孟淑芳审校
（中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室,北京100050
【摘要】治疗性单克隆抗体制品在肿瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病的治疗中均取得了显著疗效,其品种和市
场份额逐年显著提高。
随着新的治疗性单克隆抗体制品的研发和上市,不同产品的质量控制研究,特别是新技术在质量控制中的应用被提到新的高度。
由于治疗性单克隆抗体制品结构和生产的复杂性,使得质量控制的复杂程度也相应提高。
本文结合治疗性单克隆抗体质量控制的工作经验和国际上的最新进展,对治疗性单克隆抗体质量控制项目设定、标准和方法进展进行论述。
【关键词】
治疗性单克隆抗体;
质量控制;
方法;
标准
doi:
10.3969/j.issn.1672-5433.2013.01.006
TheQualityControlofTherapeuticMonoclonalAntibodyProducts
ZhangFeng/writing,MengShufang/proofreading（DivisionofMonoclonalAntibodyProductsoftheNationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,ChinaABSTRACT
Thecurativeeffectsoftherapeuticmonoclonalantibodyproductshavebeenprovedforthetreatmentof
cancer,autoimmunediseases,transplantationandinfectiousdiseases.Thevarietiesandmarketshareoftherapeuticmonoclonalantibodyproductshaverisenconsiderablyyearafteryear.Alongwiththedevelopmentandmarketingofnewtherapeuticmonoclonalantibodies,moreimportancehasbeenattachedtothequalitycontroloftheseproductssoastoensuretheirquality.Becauseofthecomplexityoftherapeuticmonoclonalantibodyproductsbothintheirstructureandmanufacturing,thequalitycontrolsoftheproductsbecomemoredifficult.Thisarticlebrieflyreviewedtheprincipleofstandardestablishmentandmethodsforthequalitycontroloftherapeuticmonoclonalantibodyproductsbasedonthelatestprogressintheworldandourworkingexperienceinthequalitycontroloftheproducts.KEYWORDS
TherapeuticMonoclonalAntibody;
QualityControl;
Method;
Specification
25
中国执业药师·
面往往通过模仿其他单抗质量控制项目和方法的方式解决质量控制问题,这种方式在确保实现质量控制目标方面存在一定的局限性。
同时,一大批新技术的出现和应用,极大地促进了单抗质量控制技术项目和方法的发展。
现结合工作经验和对单抗质量控制的理解对单抗质量控制项目和方法的研究现状进行讨论。
1抗体结构简介
抗体为通过链间二硫键连接的2条重链和2条轻链构成的“Y”形结构,重链和轻链通过链内二硫键形成多个结构域,其中重链和轻链N端的第1个结构域氨基酸序列多变,被称为可变区（VH和VL,二者为抗体同抗原结合的结构基础。
另外,重链和轻链分别有3个和1个结构域的氨基酸序列相对保守,被称为恒定区（CH和CL,重链的第2个恒定区（CH2中存在1个N糖基化位点,该位点的糖基化对其发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒效应具有重要作用[1-2],同时该糖基化位点上连接的寡糖链的唾液酸化程度对于抗体稳定性也存在重要影响[3]。
重链第3个恒定区（CH3介导抗体同Fc受体和补体的结合,从而在抗体效应的发挥和清除中发挥重要作用。
不同的抗体由于其种类和亚类不同而在重链恒定区数目、附属结构和一些细微结构中存在一定差异。
治疗性单抗一般为人鼠嵌合、人源化或人源单抗,多为IgG1亚类,可根据其治疗目的和作用机制选择其他亚类,如IgG2a,并可在抗体基本结构的基础上对抗体结构进行改造,如:
为了消除抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应而在大肠杆菌中表达或突变CH2糖基化位点;
为了消除补体激活效应而采用单臂结构或F（ab2结构;
为了提高对低抗原表达量细胞的杀伤效应而在单抗上偶联细胞毒性药物等[4]。
由于抗体对应不同的抗原特异性、其结构的复杂性、作用机制的多样性以及生产工艺的复杂性都会影响抗体的质量,因此需采用多种质量控制项目和方法对单抗的质量进行评价。
单抗的质量控制项目和方法选择是在对抗体结构与其安全性和有效性之间关系不断深入了解的基础上逐步发展的,同时,对方法的运用和对结果的解释也是在对分析方法的不断发展和深入理解的基础上而不断深入和变更的一个动态过程。
2单抗制品的质量控制项目及要求
单抗制品同其他生物制品的要求一致,质量控制是贯穿终产品生产的全过程控制,从生产用起始材料或原材料的质量控制至终产品的质量控制,根据生产工艺的不同阶段设置不同的质量控制项目要求,本文主要讨论单抗原液至终产品的质量标准及相关要求。
总体上看,单抗的质量控制项目（见表1主要包括一般项目、理化检测、含量、鉴别、纯度、活性、安全性等几个方面[5],其中安全性方面检测包括:
DNA残留、宿主细胞蛋白残留、生产过程相关外源因子和异常毒性检测。
作为对纯化工艺去除外源因子能力的验证,宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白残留和生产过程相关外源因子的检测主要在注册阶段的原液样品中进行,考虑到最适样本的问题,这些项目在成品检测中可以不检测。
在产品质量标准设定和检测方法选择的过程中,应根据制品的具体情况选择合适的检测方法,并根据工艺的稳定性、产品的安全性和有效性以及方法本身的变异情况设定合适的质量标准。
由于对结构与功能间关系认识的不断深入和检测技术的不断发展,产品的检定方法和质量标准是一个不断发展提高的过程,下面就当前单抗制品的检测方法和质量标准进行说明和论述。
3单抗质量方法研究现状及其标准制定的注意事项从表1可以看出,对于一个质量控制项目可能会采用不同的方法,从不同的侧面反映单抗的质量,特别是近年来一些新技术应用于单抗的质量控制,对单抗制品的质量控制提供了更高的保障。
但同时也需考虑到,对于单抗,表1中所列出的项目只是一个较为普遍的原则,但并不是所有的检测方法都适用于每一种单抗制品,表中所规定的标准也并非适用于所有的制品,针对于某一个特定单抗来说,都会有一些特殊的因素需要考虑,下面就不同检测方法在单抗质量控制中的作用及其标准制定时需要考虑的问题作简单分析。
在一般检测项目中的可见异物检查中,要求应无肉眼可见异物,但在一些特殊单抗制品中,由于其某些特征,如分子表面有大量疏水基团或有游
综述26
表1
单抗质量控制项目及要求
注:
BCA法:
二辛可酸法;
SEC-HPLC:
分子尺寸排阻高效液相色谱法;
ELISA法:
酶联免疫吸附法;
SDS-PAGE:
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
胶电泳;
CE-SDS:
十二烷基硫酸钠-毛细管电泳;
IEC-HPLC:
离子交换-高效液相色谱法;
CIEF:
毛细管等电聚焦电泳;
Western-Blot法:
蛋白印迹
法;
PCR:
聚合酶链反应;
Threshold法:
阈值法;
a:
可对非还原法电泳中的蛋白纯度进行相应规定;
b:
可对样品电泳条带的等电点（pI范围进行相应规定,在CIEF检测中,可对各峰面积百分比进行相应规定;
c:
需根据方法的精确性和临床试验结果制定
检测大类
检测项目
检测方法
质量标准制定参考
外观
肉眼观察
根据制品情况,制品的外观应符合要求,不得有污染和破损颜色在限定光强度条件下肉眼观察
根据制品的具体情况,为澄清或具有轻微乳光的无色或淡黄色（≤特定参比溶液液体（冻干制剂应复溶
浊度
浊度计检测根据制品的具体情况应符合要求（≤特定参比溶液
理化检测复溶时间
（仅冻干制剂人工测定符合相应规定装量
体积测定不少于标示装量装量差异称重法
符合相应规定水分（仅冻干制剂费休氏测定法不高于3.0%pH电位法在规定范围内渗透压
冰点降低法在规定范围内
不溶性微粒
光阻法
注射剂:
≥10μm微粒每瓶不得超过6000个;
≥25μm微粒每瓶不得超过600个;
眼用制剂:
≥10μm微粒每瓶不得超过50个;
≥25μm微粒每瓶不得超过5个
滴定法（Lowry法、
BCA法等测定结果应位于规定范围内SEC-HPLC测定结果应位于规定范围内SEC-HPLC单体含量不少于95%
SDS-PAGE（还原法重链+轻链含量不少于95%SDS-PAGE（非还原法同参比品一致a
CE-SDS（还原法产品峰总面积≥90%CE-SDS（非还原法电泳图谱同参比品一致a等电点测定
等电聚焦电泳同参比品一致bCIEF
同参比品一致b
毛细管区带电泳毛细管区带电泳法电泳图谱同参比品一致,且样品主峰迁移时间应位于规定范围内IEC-HPLCIEC-HPLC
酸性区、主峰、碱性区峰面积百分比位于规定范围内
肽图
胰蛋白酶等肽图法阳性（同参考图谱比较,有所有/部分特定色谱峰,
且无明显新峰N-末端氨基酸序列测定Edman降解法同理论序列一致免疫学鉴别ELISA法
阳性Western-Blot法阳性ELISA法、流式细胞术法、表
面等离子共振法、
Biacore等对参比品的相对活性在规定范围内c无菌膜过滤法/培养法无菌生长热原动物实验符合相应规定内毒素
鲎试剂测定符合相应规定宿主细胞蛋白残留ELISA法≤0.01%蛋白A残留ELISA法≤0.01%
宿主细胞DNA残留
杂交法
符合相应规定荧光定量PCR法[6]符合相应规定Threshold法[7]符合相应规定其他添加因子（如:
牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、胆固醇和其他的培养基内特殊添加物质等相应测定方法
符合相应规定
异常毒性、Tween-80、唾液酸含量等
相应测定方法符合相应规定
结合活性一般检查鉴别活性安全性
纯度蛋白纯度
可见异物
肉眼观察无肉眼可见异物分光光度法
测定结果应位于规定范围内含量蛋白含量
ELISA法
测定结果应位于规定范围内
IEC-HPLC法酸性区、主峰、碱性区峰面积百分比位于规定范围内
双向免疫扩散法
符合规定
种属鉴别
生物学活性
特定的生物学活性测定法对参比品的相对活性在规定范围内c27
离的半胱氨酸等,使其可能会形成肉眼可见的蛋白颗粒,这些制品使用时多采用在线滤器过滤的方式除去蛋白颗粒,在充分阐明颗粒性质和有具体临床研究资料的情况下,这类制品的可见异物项目检查中可以容许有肉眼可见的颗粒样物质。
含量测定中,除使用理化的分光光度法或Lowry法和二辛可酸（bicinchoninicacid,BCA法等外,还可使用免疫学的酶联免疫吸附（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA法检测。
ELISA法中如果使用特异性抗原作结合单抗的物质时,也可同时评价单抗的结合活性。
同时通过比较免疫学方法和理化方法测定的蛋白含量,还可以获得总蛋白中具有特异性结合活性的蛋白所占比例的相关信息,但是ELISA法测定单抗制品中单抗含量的过程中,需对标准品的含量和活性精确标定,否则将使测定结果产生较大的误差。
纯度检测需结合高效液相色谱（HPLC法和电泳法。
HPLC法中,分子尺寸排阻高效液相色谱法（SizeExclusiveChromatography-HPLC,SEC-HPLC侧重于检测单抗的单体、二聚体和多聚体含量百分比[8]。
离子交换色谱法（IonExchangeChromatography,IEC虽然主要用于根据电荷异质性对样品进行鉴别检测,但在某些单抗制品中,不同电荷异构体的活性具有一定差异时,需引入离子交换高效液相色谱法（IEC-HPLC进行纯度检测,并对结果中不同电荷异构体的含量百分比予以限定[9-10],以确保具有特定活性的电荷异构体所占比例达到要求。
电泳方法中包括:
十二烷基硫酸钠-毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis-Sodi-umDodecylSulphate,CE-SDS和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectropheresis,SDS-PAGE,主要用于检测单抗碎片和纯化过程中未去除的杂质蛋白,二者通常选择其中的一种即可。
SDS-PAGE方法中,为确保灵敏度,可在使用灵敏度和分辨率更高的梯度胶的同时,在电泳中设置染色对照。
由于CE-SDS检测不需要对结果进行二次处理,所以其结果较SDS-PAGE更加精确稳定客观,但受制于上样量的限制,其对杂质蛋白的检测效率不高,在某些对纯度要求较高的单抗制品中（如眼用溶液,可采用APTS（8-Aminopyren-1,3,6-trisulphon-icAcid荧光标记后使用激光诱导荧光检测器的方法提高对杂质蛋白的检出效率[11-12]。
鉴别检测中等电聚焦电泳（IsoelectroricElec-trophoresisFocusing,IEF、IEC-HPLC和肽图方法均为较常用的鉴别方法,其中胰酶肽图主要用于检测产品中发生的脱氨基、甲硫氨酸氧化、C-末端封闭和错误二硫键等结构改变[10,13-14];
IEC-HPLC方法主要用于检测样品中不同电荷异构体的比例。
IEF法中,常规的水平等电聚焦电泳方法虽然较为常用,但是其结果受电泳条件和电泳胶的影响较大,虽然使用预制胶可以在一定程度上降低变异性,但其稳定性仍然较毛细管等电聚焦电泳（CapillaryIso-ElectricFocusing,CIEF差,特别是在融合蛋白等高度糖基化的重组制品的检测中表现更为明显[15]。
ICEF在可获得较稳定结果的同时,还可对不同电荷异构体的含量进行分析,其方法包括两种,一种是传统的将样品在两性电解质中聚焦后,采用化学或物理学方法,使各聚焦条带顺序通过检测窗口并进行检测的方法;
另一种是在聚焦后,使用移动检测器对毛细管聚焦区域进行扫描并检测的方法,后者的结果稳定性明显高于前者[16]。
另外,毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis,CZE近年来也被用于单抗鉴别的方法,该方法通过蛋白分子的电荷异质性进行分离,通过对比样品同参比品迁移时间的差异对样品进行鉴别。
标准制定中规定迁移时间差异值应位于一个确定的范围内,该差异范围同使用的电泳方法的变异性相关,一般规定为应小于0.1min,且样品同标准品混合后的电泳图谱中应只有1个主峰。
使用ELISA和蛋白印迹（Western-Blot法进行鉴别时,只有使用产品特异性的抗原/抗体时才具有鉴别作用,目前一般使用通用抗体,如:
抗Fc抗体和抗IgG轻链抗体对样品进行鉴别,这种鉴别方法的结果更有利于对产品相关杂质进行检测,而在对产品进行特异性鉴别方面的意义并不显著。
单抗制品的活性检测包括结合活性和生物学活性两个方
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