治疗性单克隆抗体类制品质量控制标准的思考张峰概要文档格式.docx

1、治 疗 性 单 克隆 抗 体 的 质 量 控 制 。 E-mail :zhf5122治疗性单克隆抗体类制品质量控制标准的思考张峰 综 述 孟 淑 芳 审校（中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室 , 北京 100050【 摘要 】 治 疗 性 单 克隆 抗 体 制 品 在 肿瘤 、 自 身 免 疫 、 器官 移植 和 感染 性 疾 病的 治 疗中均取 得 了 显 著 疗效 , 其 品 种和 市场份 额 逐 年 显 著 提 高。 随 着 新 的 治 疗 性 单 克隆 抗 体 制 品 的研 发 和 上 市, 不 同产 品 的 质 量 控 制 研究 , 特别 是 新技 术在 质 量 控 制 中 的应

2、 用 被 提 到 新 的 高 度 。 由 于 治 疗 性 单 克隆 抗 体 制 品结 构 和 生 产 的 复杂 性 , 使 得 质 量 控 制 的 复杂 程 度 也 相 应 提 高。 本文结 合 治 疗 性 单 克隆 抗 体 质 量 控 制 的 工 作 经 验 和国 际 上 的最 新 进 展 , 对 治 疗 性 单 克隆 抗 体 质 量 控 制 项目 设定 、 标准 和方 法 进 展 进行 论 述 。【 关键词 】治 疗 性 单 克隆 抗 体 ; 质 量 控 制 ; 方 法 ; 标准doi :10.3969/j.issn.1672-5433.2013.01.006The Quality Con

3、trol of Therapeutic Monoclonal Antibody ProductsZhang Feng/writing , Meng Shufang/proofreading （Division of Monoclonal Antibody Products of the National Institutes for Food and Drug Control , Beijing 100050, China ABSTRACTThe curative effects of therapeutic monoclonal antibody products have been pro

4、ved for the treatment ofcancer , autoimmune diseases , transplantation and infectious diseases. The varieties and market share of therapeutic monoclonal antibody products have risen considerably year after year. Along with the development and marketing of new therapeutic monoclonal antibodies , more

5、 importance has been attached to the quality control of these products so as to ensure their quality. Because of the complexity of therapeutic monoclonal antibody products both in their structure and manufacturing , the quality controls of the products become more difficult. This article briefly rev

6、iewed the principle of standard establishment and methods for the quality control of therapeutic monoclonal antibody products based on the latest progress in the world and our working experience in the quality control of the products. KEY WORDSTherapeutic Monoclonal Antibody ; Quality Control ; Meth

7、od ; Specification25中国执业药师 面往往通过模仿其他单 抗 质 量 控 制 项 目 和 方 法 的 方式 解 决 质 量 控 制 问 题 , 这 种 方 式 在 确 保 实 现 质 量 控制目标方面存在一定的局限性 。 同时 , 一大批 新技 术 的 出 现 和 应 用 , 极 大 地 促 进 了 单 抗 质 量 控 制 技术项目和方法的发展 。 现 结 合 工 作 经 验 和 对 单抗质量控制的理解对 单 抗 质 量 控 制 项 目 和 方 法 的研究现状进行讨论 。1抗体结构简介抗 体 为 通 过 链 间 二 硫 键 连 接 的 2条 重 链 和 2条 轻 链 构 成

8、的 “ Y ” 形 结 构 , 重 链 和 轻 链 通 过 链 内 二 硫 键 形 成 多 个 结 构 域 , 其 中 重 链 和 轻 链 N 端 的 第 1个结构域氨基酸序列多变 , 被称为可变区 （VH 和 VL , 二 者 为 抗 体 同 抗 原 结 合 的 结 构 基 础 。 另 外 , 重 链 和 轻 链 分 别 有 3个 和 1个 结 构 域 的 氨 基 酸 序 列 相 对 保 守 , 被 称 为 恒 定 区 （CH 和 CL , 重 链的第 2个恒定区 （CH2 中存在 1个 N 糖基化位 点 , 该 位 点 的 糖 基 化 对 其 发 挥 抗 体 依 赖 细 胞 介 导 的 细

9、 胞 毒 效 应 具 有 重 要 作 用 1-2, 同 时 该 糖 基 化 位 点上连接的寡糖链的唾 液 酸 化 程 度 对 于 抗 体 稳 定 性也存在重要影响 3。 重链第 3个恒定区 （CH3 介 导抗体同 Fc 受体和 补 体 的 结 合 , 从 而 在 抗 体 效 应 的发挥和清除中发挥重 要 作 用 。 不 同 的 抗 体 由 于 其 种 类 和 亚 类 不 同 而 在 重 链 恒 定 区 数 目 、 附 属 结 构 和一些细微结构中存在一定差异 。治疗性单抗一般为人鼠嵌合 、 人源化或人源单 抗 , 多 为 IgG1亚 类 , 可 根 据 其 治 疗 目 的 和 作 用 机 制

10、选 择 其 他 亚 类 , 如 IgG2a , 并 可 在 抗 体 基 本 结 构 的基础上对抗体结构进行改造 , 如 :为 了 消 除 抗 体 依赖的细胞介导的细胞 毒 效 应 而 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 或 突 变 CH2糖 基 化 位 点 ; 为 了 消 除 补 体 激 活 效 应而采用单臂结构或 F （ab 2结构 ; 为了提高对低 抗原表达量细胞的杀伤 效 应 而 在 单 抗 上 偶 联 细 胞 毒性药物等 4。 由于抗体对应不同的抗原特异性 、 其 结 构 的 复 杂 性 、 作 用 机 制 的 多 样 性 以 及 生 产 工 艺 的 复 杂 性 都 会 影 响 抗 体 的

11、 质 量 , 因 此 需 采 用 多 种 质 量 控 制 项 目 和 方 法 对 单 抗 的 质 量 进 行 评 价 。 单抗的质量控制项目和 方 法 选 择 是 在 对 抗 体 结 构 与其安全性和有效性之 间 关 系 不 断 深 入 了 解 的 基 础上逐步发展的 , 同时 , 对方法的运用 和 对 结 果 的 解释也是在对分析方法 的 不 断 发 展 和 深 入 理 解 的 基础上而不断深入和变更的一个动态过程 。 2单抗制品的质量控制项目及要求单 抗 制 品 同 其 他 生 物 制 品 的 要 求 一 致 , 质 量 控 制 是 贯 穿 终 产 品 生 产 的 全 过 程 控 制 ,

12、从 生 产 用 起始材料或原材料的质 量 控 制 至 终 产 品 的 质 量 控 制 , 根 据 生 产 工 艺 的 不 同 阶 段 设 置 不 同 的 质 量 控 制 项 目 要 求 , 本 文 主 要 讨 论 单 抗 原 液 至 终 产 品 的 质量标准及相关要求 。总 体 上 看 , 单 抗 的 质 量 控 制 项 目 （见 表 1 主 要 包 括 一 般 项 目 、 理 化 检 测 、 含 量 、 鉴 别 、 纯 度 、 活 性 、 安 全 性 等 几 个 方 面 5, 其 中 安 全 性 方 面 检 测 包 括 :DNA 残 留 、 宿 主 细 胞 蛋 白 残 留 、 生 产 过 程

13、 相 关 外源因子和异常毒性检 测 。 作 为 对 纯 化 工 艺 去 除 外 源 因 子 能 力 的 验 证 , 宿 主 细 胞 DNA 、 宿 主 细 胞 蛋白残留和生产过程相 关 外 源 因 子 的 检 测 主 要 在 注册 阶 段 的 原 液 样 品 中 进 行 , 考 虑 到 最 适 样 本 的 问 题 , 这些项目在成品检测中可以不检测 。 在产品 质量标 准 设 定 和 检 测 方 法 选 择 的 过 程 中 , 应 根 据 制 品 的 具 体 情 况 选 择 合 适 的 检 测 方 法 , 并 根 据 工 艺 的 稳 定 性 、 产 品 的 安 全 性 和 有 效 性 以 及

14、方 法 本 身的变异情况设定合适 的 质 量 标 准 。 由 于 对 结 构 与功能间关系认识的不 断 深 入 和 检 测 技 术 的 不 断 发 展 , 产 品 的 检 定 方 法 和 质 量 标 准 是 一 个 不 断 发 展 提 高 的 过 程 , 下 面 就 当 前 单 抗 制 品 的 检 测 方 法 和质量标准进行说明和论述 。3单抗质量方法研究现状及其标准制定的注意事项 从 表 1可 以 看 出 , 对 于 一 个 质 量 控 制 项 目 可 能 会 采 用 不 同 的 方 法 , 从 不 同 的 侧 面 反 映 单 抗 的 质 量 , 特 别 是 近 年 来 一 些 新 技 术

15、应 用 于 单 抗 的 质 量 控 制 , 对 单 抗 制 品 的 质 量 控 制 提 供 了 更 高 的 保 障 。 但同时也需考虑到 , 对于单抗 , 表 1中 所 列 出 的项目 只 是 一 个 较 为 普 遍 的 原 则 , 但 并 不 是 所 有 的 检 测 方 法 都 适 用 于 每 一 种 单 抗 制 品 , 表 中 所 规 定 的 标 准 也 并 非 适 用 于 所 有 的 制 品 , 针 对 于 某 一 个 特定单抗来说 , 都会有一些 特 殊 的 因 素 需 要 考 虑 , 下面就不同检测方 法 在 单 抗 质 量 控 制 中 的 作 用及其标准制定时需要考虑的问题作简单分

16、析 。 在一般检测项目中的可见异物检查中 , 要求应 无肉眼可见异物 , 但在一些特殊单抗制 品 中 , 由 于 其 某 些 特 征 , 如 分 子 表 面 有 大 量 疏 水 基 团 或 有 游综述 26表 1单 抗 质 量 控 制 项 目 及 要 求注 :BCA 法:二辛可酸法; SEC-HPLC :分子尺寸排阻高效液相色谱法; ELISA 法:酶联免疫吸附法; SDS-PAGE :十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳; CE-SDS :十二烷基硫酸钠 -毛细管电泳; IEC-HPLC :离子交换 -高效液相色谱法; CIEF :毛细管等电聚焦电泳; Western-Blot 法:蛋白印迹

17、法; PCR :聚合酶链反应; Threshold 法:阈值法; a :可对非还原法电泳中的蛋白纯度进行相应规定; b :可对样品电泳条带的等电点 （pI 范围进行 相应规定, 在 CIEF 检测中, 可对各峰面积百分比进行相应规定; c :需根据方法的精确性和临床试验结果制定检测大类检测项目检测方法质量标准制定参考外观肉眼观察根据制品情况, 制品的外观应符合要求, 不得有污染和破损 颜色 在限定光强度条件下肉眼 观察根据制品的具体情况, 为澄清或具有轻微乳光的无色或淡黄色 （ 特定参比溶液 液体 （冻干制剂应复溶 浊度浊度计检测 根据制品的具体情况应符合要求 （ 特定参比溶液理化检测 复溶时

18、间（仅冻干制剂 人工测定 符合相应规定 装量体积测定 不少于标示装量 装量差异 称重法符合相应规定 水分 （仅冻干制剂 费休氏测定法 不高于 3.0%pH 电位法 在规定范围内 渗透压冰点降低法 在规定范围内不溶性微粒光阻法注射剂: 10m 微粒每瓶不得超过 6000个; 25m 微粒每 瓶不得超过 600个; 眼用制剂: 10m 微粒每瓶不得超过 50个; 25m 微粒每 瓶不得超过 5个滴定法 （Lowry 法 、BCA 法等 测定结果应位于规定范围内 SEC-HPLC 测定结果应位于规定范围内 SEC-HPLC 单体含量不少于 95%SDS-PAGE （还原法 重链 +轻链含量不少于 9

19、5%SDS-PAGE （非还原法 同参比品一致 aCE-SDS （还原法 产品峰总面积 90%CE-SDS （非还原法 电泳图谱同参比品一致 a 等电点测定等电聚焦电泳 同参比品一致 b CIEF同参比品一致 b毛细管区带电泳 毛细管区带电泳法 电泳图谱同参比品一致, 且样品主峰迁移时间应位于规定范围内 IEC-HPLC IEC-HPLC酸性区 、 主峰 、 碱性区峰面积百分比位于规定范围内肽图胰蛋白酶等肽图法 阳性 （同参考图谱比较, 有所有 /部分特定色谱峰,且无明显新峰 N -末端氨基酸序列测定 Edman 降解法 同理论序列一致 免疫学鉴别 ELISA 法阳性 Western-Blot

20、 法 阳性 ELISA 法 、 流式细胞术法 、 表面等离子共振法 、Biacore 等 对参比品的相对活性在规定范围内 c 无菌 膜过滤法 /培养法 无菌生长 热原 动物实验 符合相应规定 内毒素鲎试剂测定 符合相应规定 宿主细胞蛋白残留 ELISA 法 0.01%蛋白 A 残留 ELISA 法 0.01%宿主细胞 DNA 残留杂交法符合相应规定 荧光定量 PCR 法 6符合相应规定 Threshold 法 7符合相应规定 其他添加因子 （如:牛血清白蛋白 、 胰岛素 、 转铁蛋白 、 胆固醇和其他的 培养基内特殊添加物质等 相应测定方法符合相应规定异常毒性 、 Tween-80、 唾液酸含

21、量等相应测定方法 符合相应规定结合活性 一般检查 鉴别 活性 安全性纯度 蛋白纯度可见异物肉眼观察 无肉眼可见异物 分光光度法测定结果应位于规定范围内 含量 蛋白含量ELISA 法测定结果应位于规定范围内IEC-HPLC 法 酸性区 、 主峰 、 碱性区峰面积百分比位于规定范围内双向免疫扩散法符合规定种属鉴别生物学活性特定的生物学活性测定法 对参比品的相对活性在规定范围内 c 27离 的 半 胱 氨 酸 等 , 使 其 可 能 会 形 成 肉 眼 可 见 的 蛋 白 颗 粒 , 这 些 制 品 使 用 时 多 采 用 在 线 滤 器 过 滤 的 方 式 除 去 蛋 白 颗 粒 , 在 充 分

22、阐 明 颗 粒 性 质 和 有 具 体 临 床 研 究 资 料 的 情 况 下 , 这 类 制 品 的 可 见 异 物 项目检查中可以容许有肉眼可见的颗粒样物质 。 含量测定中 , 除使用理化的分光光度法或 Lowry 法 和 二 辛 可 酸 （bicinchoninic acid , BCA 法 等 外 , 还 可 使 用 免 疫 学 的 酶 联 免 疫 吸 附 （Enzyme Linked Immunosorbent Assay , ELISA 法检测 。 ELISA 法中 如 果 使 用 特 异 性 抗 原 作 结 合 单 抗 的 物 质 时 , 也 可 同时评价单抗的结合活 性 。 同

23、 时 通 过 比 较 免 疫 学 方 法 和 理 化 方 法 测 定 的 蛋 白 含 量 , 还 可 以 获 得 总 蛋白中具有特异性结合 活 性 的 蛋 白 所 占 比 例 的 相 关 信 息 , 但 是 ELISA 法 测 定 单 抗 制 品 中 单 抗 含 量 的过程中 , 需对标准品的含量和活性精 确 标 定 , 否 则将使测定结果产生较大的误差 。纯 度 检 测 需 结 合 高 效 液 相 色 谱 （HPLC 法 和 电泳法 。 HPLC 法中 , 分子尺寸排阻高效液相色谱 法 （Size Exclusive Chromatography-HPLC , SEC-HPLC 侧 重 于

24、检 测 单 抗 的 单 体 、 二 聚 体 和 多 聚 体 含 量 百 分 比 8。 离 子 交 换 色 谱 法 （Ion Exchange Chromatography , IEC 虽然主要用于 根 据 电 荷 异 质 性对样品进行鉴别检测 , 但在某些单抗 制 品 中 , 不 同 电 荷 异 构 体 的 活 性 具 有 一 定 差 异 时 , 需 引 入 离 子 交 换 高 效 液 相 色 谱 法 （IEC-HPLC 进 行 纯 度 检 测 , 并 对 结 果 中 不 同 电 荷 异 构 体 的 含 量 百 分 比 予 以 限 定 9-10, 以 确 保 具 有 特 定 活 性 的 电 荷

25、 异 构 体 所 占比例达到要求 。 电泳方法中包括 :十二烷基硫 酸 钠 -毛 细 管 电 泳 （Capillary Electrophoresis -Sodi-um Dodecyl Sulphate , CE-SDS 和 十 二 烷 基 硫 酸 钠 -聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electropheresis , SDS-PAGE , 主 要用于检测单抗碎片和 纯 化 过 程 中 未 去 除 的 杂 质 蛋白 , 二者通常选择其中的一 种 即 可 。 SDS-PAGE 方法中 , 为确保灵敏度 ,

26、 可在使用灵敏 度 和 分 辨 率 更高的梯度胶的同时 , 在电泳中设置染色对照 。 由 于 CE-SDS 检 测 不 需 要 对 结 果 进 行 二 次 处 理 , 所 以 其 结 果 较 SDS-PAGE 更 加 精 确 稳 定 客 观 , 但 受 制 于 上 样 量 的 限 制 , 其 对 杂 质 蛋 白 的 检 测 效 率 不 高 , 在某些对纯度要求较高的单抗制品 中 （如 眼 用 溶液 , 可采用 APTS （8-Aminopyren-1,3,6-trisulphon-ic Acid 荧 光 标 记 后 使 用 激 光 诱 导 荧 光 检 测 器 的 方法提高对杂质蛋白的检出效率

27、11-12。鉴 别 检 测 中 等 电 聚 焦 电 泳 （Isoelectroric Elec-trophoresis Focusing , IEF 、 IEC-HPLC 和 肽 图 方 法 均 为 较 常 用 的 鉴 别 方 法 , 其 中 胰 酶 肽 图 主 要 用 于 检 测 产 品 中 发 生 的 脱 氨 基 、 甲 硫 氨 酸 氧 化 、 C -末 端 封 闭 和 错 误 二 硫 键 等 结 构 改 变 10, 13-14; IEC-HPLC 方 法 主 要 用 于 检 测 样 品 中 不 同 电 荷 异 构 体 的比例 。 IEF 法中 , 常规的水平等电聚焦电泳方法 虽 然 较

28、为 常 用 , 但 是 其 结 果 受 电 泳 条 件 和 电 泳 胶 的 影 响 较 大 , 虽 然 使 用 预 制 胶 可 以 在 一 定 程 度 上 降低变异性 , 但其稳定性仍然较毛细管等电聚 焦 电 泳 （Capillary Iso-Electric Focusing , CIEF 差 , 特 别 是 在 融 合 蛋 白 等 高 度 糖 基 化 的 重 组 制 品 的 检 测 中表现更为明显 15。 ICEF 在可获得较稳定结果 的 同 时 , 还 可 对 不 同 电 荷 异 构 体 的 含 量 进 行 分 析 , 其 方 法 包 括 两 种 , 一 种 是 传 统 的 将 样 品

29、在 两 性 电 解质中聚焦后 , 采用化学或物理学方法 , 使 各 聚 焦 条 带 顺 序 通 过 检 测 窗 口 并 进 行 检 测 的 方 法 ; 另 一 种是在聚焦后 , 使用移动检测器对毛细管聚焦区域 进行扫描并检测的方法 , 后者的结果稳定性明显高 于 前 者 16。 另 外 , 毛 细 管 区 带 电 泳 （Capillary Zone Electrophoresis , CZE 近 年 来 也 被 用 于 单 抗 鉴 别 的 方法 , 该方法通过蛋白 分 子 的 电 荷 异 质 性 进 行 分 离 , 通过对比样品同参比品迁移时间的差异对样品 进行鉴别 。 标准制定中规定迁移时间

30、差异值应位于 一个确定的范围内 , 该差异范围同使用的电泳方法 的变异性相关 , 一般规定为应小于 0.1min , 且样品 同标准品混合后的电泳图谱中应只有 1个主峰 。 使 用 ELISA 和蛋白印迹 （Western-Blot 法进行鉴别 时 , 只有使用产品特异性的抗原 /抗体时才具有鉴 别作用 , 目前一般使用通用抗体 , 如 :抗 Fc 抗 体 和 抗 IgG 轻链抗体对样品进行鉴别 , 这种鉴别方法的 结果更有利于对产品相关杂质进行检测 , 而在对产 品进行特异性鉴别方面的意义并不显著 。单 抗 制 品 的 活 性 检 测 包 括 结 合 活 性 和 生 物 学 活 性 两 个 方