饲料添加剂 复合酶制剂Word格式文档下载.docx

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GB/T5917.1-2008饲料粉碎粒度测定法两层筛筛分法

GB/T6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定

GB10648饲料标签

GB/T13079-2006饲料中总砷的测定

GB/T13080-2004饲料中铅的测定原子吸收光度法

GB/T13082-1991饲料中镉的测定方法

GB/T13091-2002饲料中沙门氏菌的检测方法

GB/T14699.1-2005饲料采样

GB/T17480-2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法

GB/T18869-2002饲料中大肠杆菌的测定

JJF10750-2005定量包装商品净含量计量检验规则

NY/T722-2003饲料用酶制剂通则

国家质量监督检验检疫总局令第75号（2005）《定量包装商品计量监督管理办法》

术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

酸性蛋白酶酶活力单位

在40℃，pH3.5条件下，每一分钟水解酪素（酪蛋白）产生1µ

g酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位，以U表示。

纤维素酶酶活力单位

在40℃，pH4.8条件下，每一分钟水解羟甲基纤维素钠产生相当于1µ

g葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，以U表示。

果胶酶酶活力单位

在40℃，pH4.2条件下，每一分钟水解羟甲基纤维素钠产生1µ

g半乳糖醛所需的酶量定义为一个酶活力单位，以U表示。

淀粉酶酶活力单位

在50℃，pH4.8条件下，每一分钟水解可溶性淀粉产生1µ

要求

感官

本产品呈灰褐色到浅黑色，具有本品固有的发酵香味、无异味、异嗅，色泽一致，粒度均匀，无发霉变质。

水分

水分含量不得大于10%。

粉碎粒度

全部通过孔径为2.26mm（8目）的标准分样筛；

通过孔径为1.41mm（12目）的标准分样筛，筛上余物不得大于10%。

混合均匀度

混合应均匀。

经测试后其均匀度之变异系数（CV）应不大于7%。

酶活力

复合酶制剂的酶活力应符合表1规定。

酶活力指标

项目

指标

酸性蛋白酶酶活力，U/g≥

2000

淀粉酶酶活力，U/g≥

3000

纤维素酶酶活力，U/g≥

400

果胶酶酶活力，U/g≥

卫生指标

复合酶制剂的卫生指标应符合表2规定。

砷（以As计），mg/kg≤

3.0

铅（以Pb计），mg/kg≤

10.0

镉（以Cd计），mg/kg≤

0.5

沙门氏菌

不得检出

大肠杆菌，（个/100g）≤

黄曲霉毒素B1，（µ

g/㎏）≤

10

净含量

应符合《定量包装商品计量监督管理办法》的规定。

试验方法

将适量样品置于洁净的白色瓷盘内，在正常光线下，无异味的环境里，通过感官检验进行评定。

按GB/T6435-2006规定执行。

按GB/T5917.1-2008规定执行。

按NY/T722-2003规定执行。

酸性蛋白酶酶活力

按附录A（规范性附录）执行。

淀粉酶酶活力

按附录B（规范性附录）执行。

纤维素酶酶活力

按附录C（规范性附录）执行。

果胶酶酶活力

按附录D（规范性附录）执行。

砷

按GB/T13079-2006规定执行。

铅

按GB/T13079-2004规定执行。

镉

按GB/T13082-1991规定执行。

沙门氏菌

按GB/T13091-2002规定执行。

大肠杆菌

按GB/T18869-2002规定执行。

黄曲霉毒素B1

按GB/T17480-2008规定执行。

按JJF1070-2005规定执行。

检验规则

检验分为出厂检验和型式检验。

组批

以同一原料、同一配方、同一次投料所生产的产品为一个批次。

采样

按GB/T14699.1-2005规定执行。

出厂检验

每批产品需经公司质检部门检验合格，并附有产品合格证明方可出厂。

出厂检验项目为感官、粉碎粒度、水分、酶活力和净含量。

型式检验

6.4.1型式检验项目为本标准要求中的全部项目，型式检验样品在出厂检验合格的产品中抽取。

在保证产品质量的前提下正常生产时，每半年至少进行一次，如有以下情况之一时也应进行型式检验：

a）产品投产时；

b）原料、配方和工艺有较大变更，可能影响产品质量时；

c）停产三个月以上或主设备大修后恢复生产时；

d）出厂检验结果与最近一次型式检验结果有较大差异时。

6.4.2判定规则

检验结果卫生指标如有不合格项，则判定该批产品为不合格品；

其它项目如有不合格时，可重新在该批产品中加倍抽样或用试样留样对不合格项进行复检，复检结果如仍有不合格，则判该批产品为不合格。

标志、标签、包装、运输、贮存和保质期

标志、标签

应符合GB10648规定。

包装

本产品应使用无毒、无害、防潮、避光包装材料包装，包装封口应严密牢固。

运输

运输工具应清洁干燥，运输途中应防止日晒、雨淋，不得与有毒有害物品混运。

贮存

产品贮存在通风、阴凉、干燥的库房内。

产品堆码应离地不少于5cm。

不得与有毒有害物品混贮。

库房应有防虫、鼠害措施。

保质期

在符合本标准上述规定的贮运条件下，且包装完好的产品，保质期自生产之日起为12个月。

（规范性附录）

酸性蛋白酶酶活力测定<

福林（Folin）法>

原理

磷钨酸和磷钼酸的混合物，即福林试剂，在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还为蓝色化合物（钼蓝和钨蓝单纯合物）。

用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林试剂显蓝色反应，可从蓝色的深浅判定酶活力的多少。

试剂和溶液

福林试剂

于2000mL磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·

2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO2·

2H2O）25g，加水700mL，85%（V/V）磷酸50mL，浓硫酸100mL，文火回流10h。

取下回流冷凝器，加入硫酸锂50g，水50mL和浓溴水（99%）数滴。

再煮沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需再加溴水，再煮沸出去过量的溴）。

冷却，加水定容至1000mL。

混匀，过滤，制得到试剂应显金黄色，贮存于棕色瓶内。

或者也可以从专业试剂公司购买福林试剂成品。

使用溶液：

一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

0.4mol/L三氯乙酸

取得三氯乙酸65.4g，定容于1000mL蒸馏水中。

0.4mol/L碳酸钠溶液

称取无水碳酸钠42.4g，用少量蒸馏水加热溶解后，定容至1000mL。

0.1mol/L的乳酸钠溶液（pH3.5）

A液（0.1mol/L乳酸溶液）：

称取80%的乳酸10.6g溶解于少量蒸馏水中，再定容至1000mL；

B液（0.1mol/L乳酸钠溶液）：

称取70%的乳酸钠16.0g溶于少量蒸馏水中，再定容至1000mL；

取两份A液，一份B液混匀，即得pH3.5的缓冲液。

20mg/mL酪素（酪蛋白）溶液

称取酪素2g（精确至0.0001g），先以少量0.1mol/L乳酸湿润，然后再加4mL～5mL浓乳酸液，再以0.1mol/LpH3.5乳酸缓冲液80mL稀释，在沸水中加热，并时时搅拌使之溶解，冷却后再用0.1mol/LpH3.5乳酸缓冲液定容至100mL。

100µ

g/mLL-酪氨酸标准溶液

a）称取预先于105℃干燥恒重的L-酪氨酸0.1g（精确至0.0001g），用0.2mol/L盐酸60mL溶解后至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液；

b）吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.2mol/L盐酸定容至100mL，此溶液溶度为100µ

g/mL。

仪器和设备

可见光分光光度计；

恒温水浴锅（40℃±

0.2℃）。

分析步骤

标准曲线的绘制

不同浓度酪氨酸液的配制（按表A.1次序配制）。

A.1

100ug/mL的酪氨酸（mL）

0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00

水（mL）

109876543210

溶液浓度（g/mL）

0102030405060708090100

取不同浓度酪氨酸液各1mL，各加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林试剂，于40℃发色20min，用比色法测定其680nm吸光度（A值）。

所得A值为横坐标，酪氨酸µ

g数（即：

0µ

g/mL，10µ

g/mL，20µ

g/mL，30µ

g/mL，40µ

g/mL，50µ

g/mL，60µ

g/mL，70µ

g/mL，80µ

g/mL，90µ

g/mL，100µ

g/mL）为纵坐标，绘制标准曲线求出其回归方程。

空白的制作：

以蒸馏水代替1mL标准酪氨酸液，以下步骤同标准曲线制作。

待测酶液的制备

称取样品1g～2g（精确至0.0001g），先用少量pH3.5的乳酸缓冲液溶解，并用玻璃棒搅拌，将上清液倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再用pH3.5的乳酸缓冲液溶解。

如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用pH3.5的乳酸缓冲液定容至刻度，摇匀，用滤纸过滤，滤液供额定测定用。

测定

取上述稀释的酶液1mL（以测定时A值在0.2～0.4间为宜），在40℃水浴中预热2min，再加入同样预热的20mg/mL酪蛋白1mL，精确保温10.0min，使沉淀完全，过滤。

取滤液1mL，以下操作同标准曲线的绘制。

同时以先加氯乙酸灭活10.0min后，再加酪蛋白，沉淀过滤、发色，为空白作对照。

以下同标准曲线制作，测定吸光度（A值）。

计算

U=（4/10）K×

A×

N；

4/10——4为反应液总面积（mL），10为反应时间（min）；

K——标准曲线斜度率常数；

A——680nm光密度；

N——稀释倍数；

注：

每个试样取两个平行样同时进行测定，取其算术平均值为结果，允许相对偏差≤10%。

淀粉酶酶活力的测定

淀粉酶具有催化淀粉水解的能力，从淀粉链的非还原性末端开始，分解a-1，4糖苷键，生成葡萄糖，葡萄糖与DNS试剂发生反应，产生一种黄橙混合色，可用分光光度计测定其色度，计算其酶活力。

0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.8）

称取醋酸钠16.06g，醋酸（236%）4.92mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL。

3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21g，苯酚5g，亚酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温放置15d后使用，使用有效期为一个半月。

10mL/mL可溶性淀粉液

称取1g（精确至0.0001g）可溶性淀粉，先用少量缓冲液溶解后，徐徐倾入已煮沸的缓冲液中，继续煮沸透明冷却后用缓冲液定至100mL，冰箱保存备用。

10mg/mL葡萄糖标准液

称取1g（精确至0.0001g）分析纯葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解并定至100mL，冰箱保存备用。

仪器设备

恒温水浴锅（50℃±

0.5℃）；

可见光分光光度计。

试验步骤

葡萄糖标准曲线的绘制

分别吸取10标准葡萄糖液1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL于50mL容量瓶中，蒸馏水制成每1mL分别含有葡萄糖200µ

g，400µ

g，600µ

g，800µ

g，1000µ

g，1200µ

g的标准液。

各取不同溶度标准液0.5于试管中，加蒸馏水1.5mL，DNS试剂3mL，沸水浴中沸腾7min（样品放入后重新沸腾时算起），取出后即加入蒸馏水10mL，混匀，冷却后，在分光光度计540nm处比色，以所得的吸光度（A值）为横坐标，以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一值（即100µ

g/mL，200µ

g/mL，300µ

g/mL，400µ

g/mL，500µ

g/mL，600µ

g/mL）为纵坐标，绘制标准曲线。

空白制作：

以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。

称取样品1～2g（精确至0.0001g），先用少量0.2mol/LpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清夜倾入适应的容量瓶中，沉渣部分再用少量上述缓冲液溶解，如此反复捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定至刻度，摇匀后用滤纸过滤，滤液供测定用。

取0.5mL适当稀释的酶液加1.5mL10mg/mL的可溶性淀粉液，50℃水浴保温30min，立即加入3mLDNS，在沸水中煮沸7min，冷却后加蒸馏水10mL混匀。

0.5mLpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液加1.5mL10mg/mL的可溶性淀粉50℃反应30min做对照。

U=（K×

A/30）×

K——葡萄糖标准曲线斜率常数；

30——反应时间（30min）；

A——540nm吸光度；

N——稀释倍数。

纤维素酶（CMCE）酶活力的测定

纤维素酶从纤维素中分解出还原糖。

还原糖又同2-羟基-3，5二硝基苯甲酸发生反应，产生一种黄-橙混合色。

可用分光光度法测定其色深。

仪器

可见光分光光度计

0.2℃）

试剂

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液

溶解A（0.2mol/LNa2HPO4·

2H2O）：

称取Na2HPO4·

2H2O35g或Na2HPO4·

12H2O71.62g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL；

溶液B（0.1mol/L柠檬酸液）：

称取一水柠檬酸（C6H8O7·

H2O）20.01g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL；

取A液493mL，加入507mLB液混匀即为pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

DNS试剂

称取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5—二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21g，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌到溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用，室温下放置15d后使用，有效期一个半月。

羟甲基纤维素钠（CMCNa）溶液

称取2g（精确至0.0001g）羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）溶于200mL蒸馏水中，水浴加热至溶解，用一层纱布过滤。

取滤液100mL，加入磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液20mL，蒸馏水40mL混匀，贮于冰箱备用（一周后应重新配制）。

10mg/mL标准葡萄糖液

称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖（AR）1g（精确至0.0001g），以蒸馏水溶解，定容于100mL容量瓶中，制成10mg/mL浓度的标准葡萄糖液。

标准曲线的制作

分别吸取10mg/mL标准葡萄糖液1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水制成每1mL分别含有葡萄糖200µ

g的标准溶液。

各取不同浓度标准溶液0.5mL于试管中，加pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5mL、DNS试剂3mL沸水浴中沸腾7min（样品加入后重新沸腾时算起），取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后，在分光光度计540nm处比色，经测得的吸光度（A值）为横坐标，以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一的值（即：

测定步骤

待测酶液的制备：

称取一定量“四分法”采样取得的样品约2g（精确至0.0001g），用蒸馏水38mL浸泡，于40℃±

0.2℃浸泡45min，每15min搅拌一次。

浸泡液用滤纸过滤，所得滤液即为待测酶液。

待测酶液用pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释到一定倍数（控制测定A值在0.2～0.4之间），取经40℃预热的此稀释液0.5mL，加入经40℃预热的CMCNa液1.5mL（每个样品同时做2～3不同稀释液的梯度，每个梯度同时做两支平行试管），40℃恒温精确反应30.0min，立即加入DNS试剂3mL，立即于沸水浴中煮沸7min，终止反应，以上步骤同标准曲线制作。

取pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸0.5mL，加入DNS试剂3mL，再加入上述缓冲液1.5mL。

以上步骤同样品操作。

N

A——550nm吸光度；

30——反应时间30min；

果胶酶酶活力的测定

果胶酶主要是D-半乳糖醛酸、a-D-1，4糖苷键分子连接形成直链状聚合物。

果胶酶可使a-D-1，4糖苷键裂断，生成分子量较小的低聚物，甚至二半乳糖醛酸、半乳糖醛酸等还原性物质，根据还原性用DNS法测定。

主要仪器

恒温水浴锅40℃±

0.2℃。

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.2）

溶液A（0.2mol/LNa2HPO4·

2H2O35.60g或Na2HPO4·

称取一水柠檬酸（C6H80·

2H2O）20.01g。

用蒸馏水溶解后定容至1000mL；

取A液414mL，加入B液586mL，混匀即为pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

称取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21g，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌到溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。

贮于棕色瓶中备用，室温下放置15d后使用，有效期一个半月。

10mg/mL果胶酶溶液

称取试剂级果胶酶（美国Sigma公司产品，半乳糖醛酸含量84%，甲氧基含量9.3%），溶于50mL蒸馏水中，水浴加热至溶，再加热蒸馏水定容至100mL，用四层纱布过滤，贮冰箱备用。

7d后应重新配置。

10mg/mL标准DL-半乳糖醛酸溶液

称取DL-半乳糖醛酸0.5g（精确至0.0001g），以蒸馏水溶解，并定容至50mL，制成10mg/mL浓度的标准DL-半乳糖醛酸溶液。

分别吸取10mg/mL标准DL-半乳糖醛酸1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL于50mL于容量瓶中，加蒸馏水制成每1mL分别含有半乳糖醛酸200µ

g的标准溶液，分别取不同浓度的标准0.5mL于试管中，加入pH4.2磷酸氢二钠-柠檬酸溶液缓冲液1.5mL，再加入DNS试剂3.0mL。

立即加沸水浴沸腾7min（样品放入重新沸腾时算起），取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后，在分光光度计540nm处比色，以测得的吸光度（A值）为横坐标，对应的标准DL-半乳糖醛酸溶液浓度的二分之一值（即100µ

以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准DL-半乳糖醛酸，以下操作同标准曲线制作。

称取一定量“四分法”采样取得的样品约2g（精确至0.0001g），用蒸馏水38mL浸泡，于40℃±

0.2℃浸泡45min，每15min搅拌一次，浸泡液用滤纸过滤，所得滤液即为待测酶液。

待测酶液用pH4.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释到适当倍数（控制测定A值在0.2～0.4之间），精确吸取此稀释液0.5mL，加入pH4.2缓冲液1.0mL（每个样品作2～3个不同的梯度，每个梯度同时作两支平行试管），置40℃水浴锅预热，同时取适量10mg/mL果胶酶溶液进行预热。

吸取0.5mL10mg/mL果胶溶液，加入装有上述酶液的试管中，并立即计时，于40℃保温30.00min，取出后立即加入3mLDNS液，立即入沸水浴中煮沸7min，终止反应。

以后步骤同标准曲线操作。

1.5mLpH4.2缓冲液，加3mLDNS液，再加入0.5mg/mL果胶液，其它步骤同样品操作。

K——DL-半乳糖醛酸标准曲线斜率常数；