第十三章RNA的生物合成文档格式.docx
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①底物:
NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)
②RNA链生长方向:
5’→3’
③不需引物
④需DNA模板
反应:
1、E.coliRNA聚合酶(原核)
E.coli和其它原核细胞一样,只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA(mRNA、tRNA、rRNA)。
一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,在任一时刻,大部分聚合酶(5000左右)正在参与RNA的合成,具体数量依生长条件而定。
E.coliRNA聚合酶全酶|(holoenzyme)分子量46万Da,由六个亚基组成,α2ββ’σω,另有两个Zn2+。
无σ亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,加入σ亚基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,σ亚基称为起始因子。
E.coliRNA聚合酶各亚基的大小与功能:
亚基
亚基数
分子量(KD)
基因
功能
β’
1
160
rpoC
与模板DNA结合
β
150
rpoB
与核苷酸结合,起始和催化部位。
σ
70
rpoD
起始识别因子
α
2
37
rpoA
与DNA上启动子结合
ω
9
----
不详
不同的细菌,β’、β、α亚基分子量变化不大,σ亚基分子量变化较大,44KD~92KD。
σ亚基的功能:
核心酶在DNA上滑动,σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数,增加停留时间,使聚合酶迅速找到启动子并与之结合,σ亚基本身无催化活性。
不同的σ因子识别不同的启动子,从而表达不同的基因。
不同的原核生物,都具有相同的核心酶,但σ亚基有所差别,这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶的催化活性:
RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开,转录后DNA仍然保持双链的结构。
P360图20-1RNA聚合酶的活性中心
核心酶覆盖60bp的DNA区域,其中解链部分17bp左右,RNA-DNA杂合链约12bp。
纯的RNA聚合酶,在离体条件下可转录双链DNA,但在体内,DNA的两条链中只有一条可用于转录,这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的。
解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性,在酶的前端解螺旋,在后端以相反方向重新螺旋化,活体状况中,可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。
37℃时,RNA聚合酶的聚合速度可达40~100个核苷酸/秒
2、真核生物RNA聚合酶
真核生物的转录机制要复杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:
RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚合酶II转录mRNA,RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。
这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右,亚基数分别为6-15。
P362表20-3真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能
动物、植物、昆虫等不同来源的细胞,RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而RNApolⅠ不受抑制。
动物RNApolⅢ受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而酵母、昆虫的RNApolⅢ不受抑制。
除了细胞核RNA聚合酶外,还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶,它们的结构简单,能转录所有种类的RNA,类似于细菌RNA聚合酶。
3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶
仅为一条分子量11KD的多肽链,这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其作用,37℃时的聚合速度200nt/秒。
二、RNA聚合酶催化的转录过程(E.coli)
P361图20-2
1、起始
RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位,局部解开双螺旋,第一个核苷酸掺入转录起始位点,从此开始RNA链的延伸。
在新合成的RNA链的5’末端,通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷(pppG或pppA),即合成的第一个底物是GTP或ATP。
起始过程中,σ因子起关键作用,它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合,σ亚基与β’结合时,β’亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合,。
正链:
与mRNA序列相同的两、链。
负链:
模板链。
转录起点是+1,上游是-1。
2、延长
转录起始后,σ亚基释放,离开核心酶,使核心酶的β’亚基构象变化,与DNA模板亲和力下降,在DNA上移动速度加快,使RNA链不断延长。
转录起始后,σ亚基便从全酶中解离出来,然后nusA亚基结合到核心酶上,由nusA亚基识别序列序列。
3、终止
RNA聚合酶到达转录终止点时,在终止辅助因子的帮助下,聚合反应停止,RNA链和聚合酶脱离DNA模板链,nusA又被σ亚基所取代。
。
由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。
三、启动子和转录因子
启动子:
RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。
转录因子:
RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转录因子。
足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。
P363
(一)原核启动子结构与功能
分析比较上百种启动子序列,发现不同的启动子都存在保守的共同序列,包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。
(1)、-10序列(Pribnow框)
在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列TATAAT,称Pribnow框。
此段序列出现在-4到-13bp之间,每个位点的保守性在45%-100%。
频度:
T89A89T50A65A65T100
据预测,Pribnow框中,一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。
目前认为,Pribnow框决定转录方向。
酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物,Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶牢固的结合位点,是启动子的关键部位。
RNA聚合酶的结合,诱导富含AT的Pribnow框的双链解开,然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物,在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。
(2)、-35序列(Sexfamabox)(识别区域)
只含-10序列的DNA不能转录,在-10序列上游还有一个保守序列,其中心约在-35位置,称为-35序列,此序列为RNA酶的识别区域。
各碱基出现频率如下:
T85T83G81A61C69A52,其中TTG十分保守。
-35序列的功能:
它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。
因此,-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。
-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的启动子。
-35序列提供RNA聚合酶识别信号,
-10序列有助于DNA局部双链解开,
启动子结构的不对称性决定了转录的方向。
P364图20-4原核型启动子的结构
(二)真核启动子
真核基因的转录十分复杂,对启动子的分析要比原核基因的困难得多。
真核生物有三种RNA聚合酶:
RNA聚合酶I、II、III,分别转录rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA,这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。
1、RNA聚合酶Ⅱ的启动子
RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区:
(1)、TATA框(Hogness框)
中心在-25至-30,长度7bp左右。
碱基频率:
T82A97A85A63(T37)A83A50(T37)(全为A-T,少数含有一个G-C对)。
此序列功能:
使DNA双链解开,并决定转录的起点位置,失去TATA框,转录将可能在许多位点上开始。
TATA框的改变或缺失,直接影响DNA与酶的结合程度,会使转录起始点偏移,因此,TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。
由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构,同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离,决定了起始位点的正确选择。
启动子特定序列和酶的正确结构,这两者把酶置于一种正确的构象中,决定了识别的正确性和转录起始的正确性。
(2)、CAAT框
中心在-75处,9bp,共有序列GGT(G)CAATCT
功能:
与RNA聚合酶结合。
(3)、GC框
在CAAT框上游,序列GGGCGG,与某些转录因子结合。
CAAT和GC框均为上游序列,对转录的起始频率有较大影响。
2、RNApolⅢ的启动子
RNApolⅢ的启动子在转录区内部。
P365图20-5由RNA聚合酶III转录的三个基因的启动子
四、终止子和终止因子
终止子:
提供转录终止信号的一段DNA序列。
终止因子:
协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。
有些终止子的作用可被特异的因子所阻止,使酶越过终止子继续转录,称为通读,这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。
终止子位于已转录的序列中,DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。
P366图20-6
1、大肠杆菌中的两类终止子
P366图20-6
所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构,它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。
(1)、不依赖于ρ的终止子(简单终止子)
简单终止子除具有发夹结构外,在终止点前有一寡聚U序列,回文对称区通常有一段富含GC的序列。
寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。
(2)、依赖ρ的终止子
依赖ρ的终止子,必需在ρ因子存在时,才发生终止作用。
终止点前无寡聚U序列,回文对称区不富含GC。
ρ因子是55KD的蛋白质,可水解三磷酸核苷。
2、抗终止作用
通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。
抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。
早期基因于后基因之间以终止子相隔开,通过抗终止作用可以打开后基因的表达。
λ噬菌体前早期(immediateearly)基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。
它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读,从而表达晚早期(delayedearly)基因。
晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子,它能使晚早期基因得以表达。
五、转录过程的调节控制
参阅P367转录过程的调节控制、P450基因表达的调节
基因的表达是受到严格的调节控制的,转录水平的调控是关键的环节,转录调控主要发生在起始和终止阶段。
时序调控:
生长、发育、分化、时间程序。
适应调控:
细胞内外环境改变。
可位于基因的上游或下游区或内含子中。
操纵子:
原核生物基因表达的协调单位,包括结构基因、调节基因及由调节基因产物所识别的控制序列(启动子、操纵基因)。
增强子:
真核生物、病毒的基因组内,对转录起增强作用的一段DNA序列。
它具有长距离效应,与方向无关,只作用于同一条DNA链上的启动子。
转录水平的调控取决于调节因子(RNA或蛋白质)与启动子、增强子、终止子之间的相互作用。
(一)原核生物的转录调控
1、操纵子模型
调节基因的产物可以是负调节物(如阻遏蛋白),也可以是正调节物,它们与操纵基因作用,关闭或打开结构基因的表达
2、cAMP能促进许多原核生物的基因表达
cAMP可以活化环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein,CRP),CRP作为一种广谱性的正调节物,结合于被调控的启动子上,促进RNA聚合酶与启动子的结合,从而促进转录的进行。
葡萄糖效应:
培养基中葡萄糖含量较高时,细菌首先利用葡萄糖,阻遏利用其它底物的酶类的合成。
原因:
葡萄糖的降解物可以抑制腺苷酸环化酶的活力,并激活磷酸脂酶,因而降低cAMP的水平,使这些酶的基因不能转录。
因此,CRP又称降解物基因活化蛋白(catabolitegeneactivatorprotein,CAP)。
受cAMP-CRP调节的操纵子(既代谢降解物敏感的操纵子)包括许多负责糖类分解代谢的诱导性启动子,如乳糖操纵子,半乳糖操纵子。
,阿拉伯糖操纵子等,以及负责氨基酸合成代谢的可阻遏的操纵子,如Ile-Val操纵子(iLV)。
调节子:
受一种一种调节蛋白所控制的几个操纵子系统,这些操纵子通常都属于同一个代谢途径或与同一种功能有关。
综合性调节子:
一种调节蛋白控制几个不同代谢途径的操纵子,如cAMP-CRP对各种分解代谢和合成代谢的调控系统。
3、衰减子的调控作用
(二)真核生物的转录调控
第二节RNA转录后的加工
RNA聚合酶合成的原初转录产物,要经过剪切、修饰、拼接等过程,才能转变成成熟的RNA分子,此过程称RNA转录后的加工。
(1)、原核、真核的tRNA、rRNA(稳定的RNA)
细胞内的tRNA、rRNA相对稳定,半衰期一般为几个小时。
所有的tRNA、rRNA都不是原初转录产物,都要经过一系列的加工才能成为有活性的分子。
a.原初转录产物的5’是三磷酸(pppG、pppA),而成熟的tRNA、rRNA,5’是单磷酸。
b.成熟tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。
c.所有的tRNA分子,都有原初转录物所没有的稀有碱基(A、G、C、U以外的碱基)。
(2)、真核的mRNA
单顺反子,多内含子。
寿命比原核mRNA的长。
内含子、内元(intron):
在原初转录物中,通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列,或基因中与这种序列对应的DNA序列。
外显子、外元(exon):
原初转录物通过RNA拼接反应后,而保留于成熟RNA中的序列,或基因中与成熟RNA对应的DNA序列。
(3)、原核mRNA
多顺反子,半衰期只有几分钟。
这是原核生物重要的调控机制,如果一种酶或蛋白质不再需要时,只需简单地关闭其mRNA的合成就行了。
二、原核生物RNA的加工
在原核生物中,rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子,可提高效率、节省空间(增加有效信息)。
其它的tRNA基因也成簇存在,并与编码蛋白质的基因组成操纵子,它们在形式多顺反子转录物后,断裂成为rRNA和tRNA的前体,然后进一步加工成熟。
1、原核rRNA前体的加工(E.coli)
P370图20-7E.colirRNA前体的加工
E.coli共有三种rRNA
5SrRNA120b
16SrRNA1541b
23SrRNA2904b
rRNA原初转录物含6300个核苷酸,约30S。
大肠杆菌有7个rRNA的转录单位(操纵子),它们分散在基因组的各处。
每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一个或几个tRNA基因所组成。
每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同。
RNAaseⅢ是一种rRNA、多顺反子mRNA加工的内切酶,识别特定的RNA双螺旋区。
RNAaseE也可识别P5(5SrRNA前体)两端形成的双螺旋区。
2、原核tRNA前体的加工
P371图20-8
E.coli染色体基因组有60个tRNA基因,即某种a.a.的tRNA基因不止一个拷贝。
tRNA基因大多成簇存在,或与rRNA基因,或与蛋白质基因组成混合转录单位。
tRNA前体加工步骤
a.核酸内切酶(RNAaseP、RNAaseF)在tRNA两端切断。
b.核酸外切酶(RNAaseD)从3’端逐个切去附加序列。
c.在tRNA3’端加上-CCA-OH。
tRNA核苷酰转移酶
d.核苷的修饰(修饰酶):
甲基化酶/S-腺苷蛋氨酸(SAM),假尿苷合成酶。
(1)、RNAaseP
能识别空间结构,很干净地切除tRNA前体的5’端。
含有蛋白质和RNA(M1RNA)两部分。
M1RNA含375nt,在某些条件下,(提高[Mg2+]、或加入胺类),RNAaseP的RNA能单独地切断tRNA前体的5’端序列。
(2)、RNAaseF
不干净地切除tRNA前体的3’端序列,需要RNAaseD进一步修剪。
3、原核mRNA前体的加工
由单顺反子构成mRNA,一般不需加工,一经转录,即可直接进行翻译。
有些多顺反子构成的mRNA,须由核酸内切酶切成较小的mRNA,然后再进行翻译。
例:
核糖体大亚基蛋白L10、L7、L12与RNA聚合酶β、β’亚基的基因组成混合操纵子。
它在转录出多顺反子mRNA后,由RNAaseⅢ将核糖体蛋白质基因与聚合酶亚基基因的mRNA切开,然后各自翻译。
该加工过程的意义:
可对mRNA的翻译进行调节,核糖体蛋白质的合成必须适应于rRNA的合成水平,而细胞内RNA聚合酶的合成水平则要低得多。
两者切开,有利于各自的翻译调控。
三、真核生物RNA的加工
真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似,但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。
1、真核rRNA前体的加工
真核生物核糖体的小亚基含:
16-18SrRNA,大亚基含:
26-28SrRNA、5SrRNA、5.8SrRNA(特有)。
真核rRNA基因拷贝数较多,几十至几千个之间。
真核rRNA基因也成簇排列在一起,18S、5.8S、28SrRNA基因组成一个转录单位,彼此被间隔区分开,由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。
5SrRNA基因也成簇排列,间隔区不被转录,由RNA聚合酶III转录后经适当加工。
哺乳动物:
45SrRNA前体,含18S、5.8S、28SrRNA
果蝇:
38SrRNA前体,含18S、5.8S、28SrRNA
酵母:
37SrRNA前体,17S、5.8S、26SrRNA
rRNA在成熟过程中可被甲基化,位点主要在核糖2’-OH上。
真核rRNA甲基化程度比原核的高,约1-2%的核苷酸被甲基化。
真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所,大、小亚基分别组装后,通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。
2、真核tRNA前体的加工
真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。
例如,E.coli有60个tRNA基因,啤酒酵母250个,果蝇850个,爪蟾1150个,人1300个。
真核tRNA基因也成簇排列,被间隔区分开,tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录。
真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。
3、真核生物mRNA前体的加工
mRNA原初转录物是分子量很大的前体,在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物,它们被称为核内不均一RNA(hnRNA)。
其中,约有25%可转变成成熟的mRNA。
hnRNA半寿期很短,比细胞质中的mRNA更不稳定,一般在几分钟至1小时。
而细胞质mRNA的半寿期为1-10小时,神经细胞mRNA最长可达数年。
hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括:
a.5’末端形成帽子结构
b.3’末端切断并加上polyA
c.剪接除去内含子对应的序列
d.甲基化
(1)、5’末端加帽
反应步骤P374
RNA三磷酸酶,mRNA鸟苷酰转移酶,mRNA(鸟嘌呤-7)甲基转移酶,mRNA(核苷-2’)甲基转移酶。
由于甲基化的程度不同,有三种类型的帽子:
CAPO型,CAPI型,CAPII型。
★5’帽子也出现于hnRNA,说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。
★5’帽子的功能
a.在翻译过程中起信号识别作用,协助核糖体与mRNA结合,使翻译从AUG开始。
b.保护mRNA,避免5’端受核酸外切酶的降解。
(2)、3’端加polyA
hnRNA链由RNAaseⅢ切断,由多聚腺苷酸聚合酶催化,加上polyA,ATP为供体。
加尾信号:
AATAAA、YGTGTGYY(Y为嘧啶)。
高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端区都有一段非常保守的序列AAUAAA,这一序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。
核内hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸,表明加尾过程早在核内已经完成。
hnRNA中的poly(A)比mRNA略长,平均150-200nt。
polyA的功能
a.防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解,起缓冲作用。
b.与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。
3’脱氧腺苷(既冬虫夏草素)是多聚腺苷酸化的特异抑制剂,但它不抑制hnRNA的转录。
(3)、mRNA甲基化
某些真核mRNA内部有甲基化的位点,主要是在N6-甲基腺嘌呤(m6A)。
四、RNA的拼接和催化作用(内含子的切除)
多数真核基因是断裂基因,其转录产物通过拼接,去除内含子,使编码区(外显子)成为连续序列。
有些内含子可以催化自身的拼接(self-splicing),有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。
1、tRNA前体的拼接
酵母tRNA约有400个基因,有内含子的基因约占1/10,内含子长度14-46bp,没有保守性。
切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构,而不是什么保守序列。
拼接过程:
第一步切除内含子,第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接。
P375图20-9酵母tRNAPhe及其前体的结构
P376图20-10酵母和植物tRNA前体的拼接过程
2、四膜虫rRNA前体的自我拼接
四膜虫35SrRNA前体,经加工可以生成5.8S、17S和26SrRNA。
某些品系的四膜虫在其26SrRNA基因中有一个内含子,35SrRNA前体需要拼接除去内含子。
该拼接过程只需一价和二价阳离子和鸟苷酸(提供3’-OH),无需能量和酶。
P377图20-11四膜虫rRNA的拼接
3、mRNA前体的拼接
真核生物所有编码蛋白质的核结构基因,其内含子的左端均为GT,右端均为AG。
此规律称GT-AG规律(对于mRNA就是GU-AG,此规律不适合于线粒体、叶绿体的内含子,也不适合于tRNA和某些rRNA的核结构基因)
酵母核基因的内含子在靠近3’端还有一个保守序列,与5’端序列互补,称为TACTAACbox,也与拼接有关。
真核细胞内存在许多种类的小分子RNA,大小在100-300