第十三章RNA的生物合成文档格式.docx

1、底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）RNA链生长方向：53不需引物需DNA模板反应：1、 E.coli RNA聚合酶（原核）E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000左右）正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。E.coli RNA聚合酶全酶|（holoenzyme）分子量46万Da，由六个亚基组成，2 ，另有两个Zn2+。无亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，而不具备起始合成活性，加入亚基后，全酶才具有起始合成

2、RNA的能力，因此，亚基称为起始因子。E.coli RNA聚合酶各亚基的大小与功能：亚基亚基数分子量（KD）基因功能1160rpoC与模板DNA结合150rpoB与核苷酸结合，起始和催化部位。70rpoD起始识别因子237rpoA与DNA上启动子结合9-不详不同的细菌，、亚基分子量变化不大，亚基分子量变化较大，44KD92KD。亚基的功能：核心酶在DNA上滑动，亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，亚基本身无催化活性。不同的因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。

3、RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。P360 图20-1RNA聚合酶的活性中心核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分17bp左右，RNA-DNA杂合链约12bp。纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录，这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了亚基引起的。解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。37时，RNA聚合酶的聚合速度可达40100个核

4、苷酸/秒2、 真核生物RNA聚合酶真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右，亚基数分别为6-15。P362 表20-3 真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，RNApol的活性都可被低浓度的-鹅膏蕈碱抑制，而RNApol不受抑制。动物RNApol受高浓度的-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的RNApol不受抑制。除了细胞核RNA聚合酶外，还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所

5、有种类的RNA，类似于细菌RNA聚合酶。3、 噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶仅为一条分子量11KD的多肽链，这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子，并无选择地与其作用，37时的聚合速度200nt/秒。二、 RNA聚合酶催化的转录过程（E.coli）P361 图20-21、 起始RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位，局部解开双螺旋，第一个核苷酸掺入转录起始位点，从此开始RNA链的延伸。在新合成的RNA链的5末端，通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG或pppA），即合成的第一个底物是GTP或ATP。起始过程中，因子起关键作用，它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合，亚基与结合时

6、，亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合，。正链：与mRNA序列相同的两、链。负链：模板链。转录起点是+1，上游是-1。2、 延长转录起始后，亚基释放，离开核心酶，使核心酶的亚基构象变化，与DNA模板亲和力下降，在DNA上移动速度加快，使RNA链不断延长。转录起始后，亚基便从全酶中解离出来，然后nusA亚基结合到核心酶上，由nusA亚基识别序列序列。3、 终止RNA聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子的帮助下，聚合反应停止，RNA链和聚合酶脱离DNA模板链，nusA又被亚基所取代。由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。三、 启动子和转录因子启动子：RNA聚合酶识别、结合并

7、开始转录所必需的一段DNA序列。转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。P363（一） 原核启动子结构与功能分析比较上百种启动子序列，发现不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。（1）、 -10序列（Pribnow框）在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间，每个位点的保守性在45%-100%。频度： T89 A89 T50 A65 A65 T100据预测，Pribnow框中，一开始的T

8、A和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。目前认为，Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物，Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。RNA聚合酶的结合，诱导富含AT的Pribnow框的双链解开，然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物，在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。（2）、 -35序列（Sexfama box）（识别区域）只含-10序列的DNA不能转录，在-10序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列，此序列为RNA酶的识别区域。

9、各碱基出现频率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。-35序列的功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠因子的初始识别位点。因此，-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。-35序列提供RNA聚合酶识别信号，-10序列有助于DNA局部双链解开，启动子结构的不对称性决定了转录的方向。P364 图20-4 原核型启动子的结构（二） 真核启动子真核基因的转录十分复杂，对启动子的分析要比原核基因的困难得多。真核生物有三种RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分别转录rRNA、m

10、RNA、tRNA和小分子RNA，这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。1、 RNA聚合酶的启动子RNA聚合酶的启动子有三个保守区：（1）、 TATA框（Hogness框）中心在-25至-30，长度7bp左右。碱基频率：T82 A97 A85 A63 （T37 ）A83 A50（T37 ）（全为A-T，少数含有一个G-C对）。此序列功能：使DNA双链解开，并决定转录的起点位置，失去TATA框，转录将可能在许多位点上开始。TATA框的改变或缺失，直接影响DNA与酶的结合程度，会使转录起始点偏移，因此，TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构，同此框的结合位

11、点和转录反应催化位点的距离，决定了起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构，这两者把酶置于一种正确的构象中，决定了识别的正确性和转录起始的正确性。（2）、 CAAT框中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT功能：与RNA聚合酶结合。（3）、 GC框在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。CAAT和GC框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。2、 RNApol的启动子RNApol的启动子在转录区内部。P365图20-5 由RNA聚合酶III转录的三个基因的启动子四、 终止子和终止因子终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。终止因子：协助RNA聚合酶识

12、别终止子的蛋白质辅助因子。有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。P366图20-61、 大肠杆菌中的两类终止子P366图20-6 所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。（1）、 不依赖于的终止子（简单终止子）简单终止子除具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列，回文对称区通常有一段富含GC的序列。寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。（2）、 依赖的终止子依赖的终止子，必需在

13、因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。因子是55KD的蛋白质，可水解三磷酸核苷。2、 抗终止作用通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。早期基因于后基因之间以终止子相隔开，通过抗终止作用可以打开后基因的表达。噬菌体前早期（immediate early）基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读，从而表达晚早期（delayed early）基因。晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它能使晚早期基因得以表达。五、 转录过程的调节控制参阅P367转录过程的调节控制、P450基

14、因表达的调节基因的表达是受到严格的调节控制的，转录水平的调控是关键的环节，转录调控主要发生在起始和终止阶段。时序调控：生长、发育、分化、时间程序。适应调控：细胞内外环境改变。可位于基因的上游或下游区或内含子中。操纵子：原核生物基因表达的协调单位，包括结构基因、调节基因及由调节基因产物所识别的控制序列（启动子、操纵基因）。增强子：真核生物、病毒的基因组内，对转录起增强作用的一段DNA序列。它具有长距离效应，与方向无关，只作用于同一条DNA链上的启动子。转录水平的调控取决于调节因子（RNA或蛋白质）与启动子、增强子、终止子之间的相互作用。（一） 原核生物的转录调控1、 操纵子模型调节基因的产物可以

15、是负调节物（如阻遏蛋白），也可以是正调节物，它们与操纵基因作用，关闭或打开结构基因的表达2、 cAMP能促进许多原核生物的基因表达cAMP可以活化环腺苷酸受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP），CRP作为一种广谱性的正调节物，结合于被调控的启动子上，促进RNA聚合酶与启动子的结合，从而促进转录的进行。葡萄糖效应：培养基中葡萄糖含量较高时，细菌首先利用葡萄糖，阻遏利用其它底物的酶类的合成。原因：葡萄糖的降解物可以抑制腺苷酸环化酶的活力，并激活磷酸脂酶，因而降低cAMP的水平，使这些酶的基因不能转录。因此，CRP又称降解物基因活化蛋白（catabolite gene act

16、ivator protein,CAP）。受cAMP-CRP调节的操纵子（既代谢降解物敏感的操纵子）包括许多负责糖类分解代谢的诱导性启动子，如乳糖操纵子，半乳糖操纵子。，阿拉伯糖操纵子等，以及负责氨基酸合成代谢的可阻遏的操纵子，如Ile-Val操纵子（iLV）。调节子：受一种一种调节蛋白所控制的几个操纵子系统，这些操纵子通常都属于同一个代谢途径或与同一种功能有关。综合性调节子：一种调节蛋白控制几个不同代谢途径的操纵子，如cAMP-CRP对各种分解代谢和合成代谢的调控系统。3、 衰减子的调控作用（二） 真核生物的转录调控第二节 RNA转录后的加工RNA聚合酶合成的原初转录产物，要经过剪切、修饰、拼

17、接等过程，才能转变成成熟的RNA分子，此过程称RNA转录后的加工。（1）、 原核、真核的tRNA、rRNA（稳定的RNA）细胞内的tRNA、rRNA相对稳定，半衰期一般为几个小时。所有的tRNA、rRNA都不是原初转录产物，都要经过一系列的加工才能成为有活性的分子。a. 原初转录产物的5是三磷酸（pppG、pppA），而成熟的tRNA、rRNA ，5是单磷酸。b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。c. 所有的tRNA分子，都有原初转录物所没有的稀有碱基（A、G、C、U以外的碱基）。（2）、 真核的mRNA单顺反子，多内含子。寿命比原核mRNA的长。内含子、内元（intron）：在

18、原初转录物中，通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列，或基因中与这种序列对应的DNA序列。外显子、外元（exon）：原初转录物通过RNA拼接反应后，而保留于成熟RNA中的序列，或基因中与成熟RNA对应的DNA序列。（3）、 原核mRNA多顺反子，半衰期只有几分钟。这是原核生物重要的调控机制，如果一种酶或蛋白质不再需要时，只需简单地关闭其mRNA的合成就行了。二、 原核生物RNA的加工在原核生物中，rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，可提高效率、节省空间（增加有效信息）。其它的tRNA基因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成操纵子，它们在形式多顺反子转录物后，断裂成为rRNA和tRNA

19、的前体，然后进一步加工成熟。1、 原核rRNA前体的加工（E.coli）P 370图20-7 E.coli rRNA前体的加工E.coli共有三种rRNA5S rRNA 120b16S rRNA 1541b23S rRNA 2904brRNA原初转录物含6300个核苷酸，约30S。大肠杆菌有7个rRNA的转录单位（操纵子），它们分散在基因组的各处。每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一个或几个tRNA基因所组成。每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同。RNAase是一种rRNA、多顺反子mRNA加工的内切酶，识别特定的RNA双螺旋区。RNAase E也

20、可识别P5（5SrRNA前体）两端形成的双螺旋区。2、 原核tRNA前体的加工 P371图20-8E.coli染色体基因组有60个tRNA基因，即某种a.a.的tRNA基因不止一个拷贝。tRNA基因大多成簇存在，或与rRNA基因，或与蛋白质基因组成混合转录单位。tRNA前体加工步骤a. 核酸内切酶（RNAaseP、RNAaseF）在tRNA两端切断。b. 核酸外切酶（RNAaseD）从3端逐个切去附加序列。c. 在tRNA3端加上-CCA-OH。tRNA核苷酰转移酶d. 核苷的修饰（修饰酶）：甲基化酶 / S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。（1）、 RNAase P能识别空间结构，很干净

21、地切除tRNA前体的5端。含有蛋白质和RNA（M1 RNA）两部分。M1 RNA含375nt，在某些条件下，（提高Mg2+、或加入胺类），RNAase P的RNA能单独地切断tRNA前体的5端序列。（2）、 RNAaseF不干净地切除tRNA前体的3端序列，需要RNAase D进一步修剪。3、 原核mRNA前体的加工由单顺反子构成mRNA，一般不需加工，一经转录，即可直接进行翻译。有些多顺反子构成的mRNA，须由核酸内切酶切成较小的mRNA，然后再进行翻译。例：核糖体大亚基蛋白L10、L7、L12与RNA聚合酶、亚基的基因组成混合操纵子。它在转录出多顺反子mRNA后，由RNAase将核糖体蛋白

22、质基因与聚合酶亚基基因的mRNA切开，然后各自翻译。该加工过程的意义：可对mRNA的翻译进行调节，核糖体蛋白质的合成必须适应于rRNA的合成水平，而细胞内RNA聚合酶的合成水平则要低得多。两者切开，有利于各自的翻译调控。三、 真核生物RNA的加工真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似，但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。1、 真核rRNA前体的加工真核生物核糖体的小亚基含：16-18S rRNA，大亚基含：26-28S r RNA、5S rRNA、5.8S rRNA（特有）。真核rRNA基因拷贝数较多，几十至几千个之间。真核rRNA基因也成簇排列在一起，18S、5.8S、28S

23、 rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。5SrRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶III转录后经适当加工。哺乳动物：45SrRNA前体，含18S、5.8S、28S rRNA果蝇：38SrRNA前体，含18S、5.8S、28S rRNA酵母：37SrRNA 前体，17S、5.8S、26S rRNArRNA在成熟过程中可被甲基化，位点主要在核糖2-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，约1-2%的核苷酸被甲基化。真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所，大、小亚基分别组装后，通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环

24、。2、 真核tRNA前体的加工真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60个tRNA基因，啤酒酵母250个，果蝇850个，爪蟾1150个，人1300个。真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶转录。真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。3、 真核生物mRNA前体的加工mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA（hn RNA）。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。hnRNA半寿期很短，比细胞质中的mRNA更不稳定，一般在几分钟至1小时。而细胞质mRNA的半寿期为1-

25、10小时，神经细胞mRNA最长可达数年。hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括：a. 5末端形成帽子结构b. 3末端切断并加上polyAc. 剪接除去内含子对应的序列d. 甲基化（1）、 5末端加帽反应步骤P 374RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶，mRNA（核苷-2）甲基转移酶。由于甲基化的程度不同，有三种类型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。5帽子也出现于hnRNA，说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。5帽子的功能a. 在翻译过程中起信号识别作用，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。b. 保护mRNA，

26、避免5端受核酸外切酶的降解。（2）、 3端加polyA hnRNA链由RNAase切断，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体。加尾信号：AATAAA、YGTGTGYY（Y为嘧啶）。高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3端区都有一段非常保守的序列AAUAAA，这一序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。核内hnRNA的3端也有多聚腺苷酸，表明加尾过程早在核内已经完成。hnRNA中的poly（A）比mRNA略长，平均150-200nt。polyA的功能a. 防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓冲作用。b. 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。3脱氧腺苷（既冬虫

27、夏草素）是多聚腺苷酸化的特异抑制剂，但它不抑制hnRNA的转录。（3）、 mRNA甲基化某些真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。四、 RNA的拼接和催化作用（内含子的切除）多数真核基因是断裂基因，其转录产物通过拼接，去除内含子，使编码区（外显子）成为连续序列。有些内含子可以催化自身的拼接（self-splicing）,有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。1、 tRNA前体的拼接酵母tRNA约有400个基因，有内含子的基因约占1/10，内含子长度14-46bp，没有保守性。切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是什么保守序列。拼接过程：第一步切除内含子

28、，第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接。P375图20-9酵母tRNAPhe及其前体的结构P376图20-10酵母和植物tRNA前体的拼接过程2、 四膜虫rRNA前体的自我拼接四膜虫35S rRNA前体，经加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。某些品系的四膜虫在其26SrRNA基因中有一个内含子，35S rRNA前体需要拼接除去内含子。该拼接过程只需一价和二价阳离子和鸟苷酸（提供3-OH），无需能量和酶。P377图20-11四膜虫rRNA的拼接3、 mRNA前体的拼接真核生物所有编码蛋白质的核结构基因，其内含子的左端均为GT，右端均为AG。此规律称GT-AG规律（对于mRNA就是GU-AG，此规律不适合于线粒体、叶绿体的内含子，也不适合于tRNA和某些rRNA的核结构基因）酵母核基因的内含子在靠近3端还有一个保守序列，与5端序列互补，称为TACTAAC box，也与拼接有关。真核细胞内存在许多种类的小分子RNA，大小在100-300