复合维生素B片中VB2的荧光分光光度法检测研究毕业论文Word格式文档下载.docx

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B族维生素大部分都是辅酶，在蛋白质、脂肪、糖等有机物的代谢中有着特殊的效果。

其中维生素B2与碳水、蛋白质、脂肪的转化有关，可以增加生命体对碳水的使用效果，加快组织的成长，加快细胞内线粒体的产生，加快细胞膜的流动速度进而提高细胞对外界物质吸收速度，维持表皮组织稳定性。

在最新的研究中发现了VB2可用于治疗心绞痛、偏头痛，对癌症进行预防等，维生素B2不会在人体内积累，因此我们经常需要用食品或者药品来进行补充，所以对药品中的维生素B2的含量测定是十分必要的。

1.2维生素B2的发现历史

维生素B2是在二十世纪初被发现的，英国化学家发现牛乳表层乳液中有着一些黄色荧光物质，他们用各种方法提取，想要发现这种色素的化学本质，但是没有成功。

在那之后，世界各地的科学家都在多种动物、植物的各个部位中发现这种荧光色素，但都无法进行确认，直到科学家们从1吨牛奶中提取到18毫克这样的色素，通过仪器进行检测，图谱上显示有核糖醇基团在其分子上，所以核黄素就是维生素B2的通用术语。

1.3维生素B2的结构

维生素B2的分子式C17H20N4O6，相对分子质量是376.4，具有橘黄色针型晶体或颗粒状的外观，微臭，在水中的溶解度很低，在水溶液中呈现出黄绿色的荧光。

维生素B2热稳定良好，抗氧化。

其对光（特别是紫外线）辐射敏感。

在光或紫外线的照射下可引起不可逆的分解反应。

维生素B2分子中异吡嗪上1，5位氮的活性共轭双键可以做提供氢离子的位置，也是做氢离子接受的位置。

维生素B2可以将黄素腺嘌呤二核苷酸和黄体素单核苷酸加入到ATP的分解与合成反应中，并且维生素B2具有传递特定离子的效果，是人体内不可缺少的辅助酶。

结构如图1-1所示。

图1-1VB2结构示意图

1.4维生素B2的作用

核黄素主要参与的反应包括细胞膜与特定的离子结合，能量转化，脂肪和氨基酸的氧化，嘌呤碱向其他嘌呤的转化，蛋白质与某些荷尔蒙的产生，金属元素的运转、保存及激活，以及某些酸、吡哆醛的排出等。

核黄素被人体中吸收速度较快，而它被排出体外的速度也快，并且它不会在体内累积，因此我们经常需要用食品或者滋养品来进行增补。

维生素B2在各种物质中含量丰富，但无细胞壁生物中维生素B2的含量远高于拥有细胞壁的生物。

其中大量含有维生素B2的食物，譬如动物内脏、鸡蛋、奶以及鱼类等。

许多绿色蔬菜以及豆亚目中含量也多，但麻类，麦类，稷类和其他蔬菜含量较少。

所以，为了补充机体所需要维生素B2，除了每日中多次食用动物的内脏、卵类、奶制品等食品，还要多摄入富含维生素B2的植物类食品，以及有对维生素B2进行保存方式尽可能的了解以减少VB2在对食物进行烹调与贮存过程之中的消耗。

获取不够、大量的饮酒以及某些药物的使用，譬如治疗精神病类的药品：

普吗嗪、丙咪嗪，都会使维生素B2变化为活性辅酶的数量减少，从而导致VB2的贫乏症发作。

VB2轻度缺乏不会引起明显症状，但VB2严重缺乏会导致许多症状：

轻度和中度缺铁性贫血、口腔生殖综合征，长期缺乏会减缓儿童生长以及其他维生素缺乏。

1.5常用VB2的测定方法

近几年对维生素B2的定量分析方法不断发展，其中VB2的测定方法可分为：

高效液相色谱法、紫外分光光度法、微生物法、荧光分析法等。

1.5.1高效液相色谱法

虽然高效液相色谱法拥有可以一次进行三十多种污染物监测的成功事例，并且对于维生素B2的测定，具有样品处理简单，使用量较低，分离速度快的特点，并且可以进行多种维生素的测定，但实验费时费力，并且需要熟练的操作。

梁改玲等人使用高效液相色谱法测量了部分药片中的维生素B2的百分比含量，结果理想；

贺利民等人使用高效液相色谱法同时进行测量多种维生素，但方法误差较大；

张萍等人使用高效液相色谱法测定了植物果核中的维生素B2，实验结果较为理想；

潘建国等人采用高效液相色谱法测定特定花粉中的各种维生素的含量，但分离时间短，使得只能在部分条件下存在着线性关系。

1.5.2紫外分光光度法

维生素B2在紫外光谱上有多处吸收峰，但维生素B2在444nm处的强度峰最为清晰，所以一般在此波长进行测定。

该法虽然具有快速、操作简便、测定准确等优点，但处理维生素时，会出现吸收光谱多次重叠，以致于得出数据较少，使得结果不理想。

王有志等人通过使用BP人工神经网络分析测定得到的紫外光谱，获得了药品中VB2的所占百分比，但该实验数据处理过程复杂，而且处理数据所需的计算机程序也不易制作；

杨敏等人使用多元线型分析法对维生素B2的紫外光谱进行分析，测定了药品中VB2含量，但此法对维生素B2的预处理十分复杂，繁琐。

1.5.3荧光分光光度法

维生素B2在光照条件下易产生不可逆转反应，在酸性溶液中较为稳定，但碱性溶液中易分解。

如果将维生素B2放入碱性溶液中进行测定会使得核糖醇发生分解，形成光黄素以及一些游离基团，但在非碱性溶液中进行测定，会产生拥有其他颜色的色素以及少量光黄素。

光黄素的氧化能力高于维生素B2的氧化能力，所以可以让其他荧光物质加速分解，而光黄素自身会发出与维生素B2一样的荧光色，光黄素的荧光强度相比于维生素B2所产生的荧光强度要大很多，所以能够使用荧光法对其测定。

这也就是测定核黄素含量的理论基础。

维生素B2在特定波长下产生荧光，在一定浓度中会与荧光强度有着一定的关系，而且呈正相关，所以使用荧光分析进行测定。

陈小明等人使用柱层析光纤荧光检测器测定药品中的维生素B2，取得良好的结果，但此法操作繁琐；

许金钩等人使用3D光谱积分法对维生素B2进行含量测定，结果理想；

陈华章等人使用多柱层分析荧光检测仪对维生素B2测定，测定过程省时，但此法药品预处理较为麻烦。

1.5.4微生物研究法

这是近几年出现的一种结合生物培养学的分析方法，其理论基础为某种乳酸菌在一定条件的培养基中进行生长，当其他条件一定时，培养基中维生素B2的浓度与乳酸量有着一定的比例关系。

利用这一理论，就可在确定其他条件时，研究加入不同浓度维生素B2营养液下的培养基，在接入菌落进行一段时间培养后，测定乳酸的含量，继而计算得到维生素B2含量。

1.6本论文的研究内容

1.6.1维生素B2测定条件的选择

当其他条件不变，在25℃、35℃、45℃这三个温度下，对维生素B2的荧光强度进行测量，得出维生素B2的荧光强度会受温度影响，其中35℃对测定影响效果最小。

当其他条件不变，在pH=5、7、9，对维生素B2的荧光强度进行测定，得出荧光强度会随着pH的改变而改变，但影响效果最小的pH值为7。

当其他条件不变，改变阳离子种类，在阳离子为Na+、Mg2+、H+，其中Na+、Mg2+的浓度分别为1.4*10-2mol/L，1.75*10-2mol/L时，对维生素B2的荧光强度进行测定，结果表明阳离子对测定产生较小影响，其中影响最小的为H+。

1.6.2维生素B2含量的测定

选择35℃，在PH为7且阳离子为H+的条件下，进行药品含量的测定，得出药品中的含量为0.00438g/片。

2实验部分

2.1实验药品

表2-1实验药品

名称

分子式

摩尔量

含量

规格

产地

氯化钠

NaCl

58.44

≥99.5%

分析纯

天津市河东区红岩试剂厂

氢氧化钠

NaOH

40.00

≥96.0%

优级纯

天津市光复科技发展有限公司

氯化镁

MgCl2·

6H2O

203.30

≥98.0%

天津市大茂化学试剂厂

维生素B2

C17H20N4O6

376.37

≥97.5%

生物试剂

复合维生素B片

山西太原药业有限公司

2.2实验仪器

电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司；

日立F-7000荧光分光光度计，天美（中国）科学仪器有限公司。

2.3实验步骤

2.3.1标准溶液预处理

称取标准品10mg，放入100ml量瓶，使用蒸馏水标定后，置60℃水浴锅加热1小时，溶解，冷却加蒸馏水标定，摇匀，移1ml，至于100ml量瓶中，加蒸馏水标定，吸取3ml至于10ml带塞比色管中加蒸馏水稀释（0.3ug/ml）。

2.3.2激发波长的选定

使用荧光分光光度计在发射波长为510nm-530nm进行扫描，可以确定激发波长。

2.3.3不同条件对荧光强度的影响的探究

称取标准品10mg，溶解，至100ml容量瓶中，摇匀，移1ml，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水标定，取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml分别置于10ml带塞比色管中，加水稀释置刻度，然后将加热后的比色管中液体放入荧光分光光度仪中进行测定，绘制曲线。

内容如表2-2所示

表2-2实验内容

温度

25℃

35℃

45℃

pH值

5

7

9

阳离子

Na+

H+

Mg+

2.3.4VB2标准曲线的绘制

称取标准品10mg，溶解，于100ml容量瓶中，摇匀，移1ml，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水标定，取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml分别置于10ml带塞比色管中，加蒸馏水标定，然后用确定的激发光波长以及适当的测定条件去测定其荧光强度，之后绘制标准曲线。

2.3.5维生素B2含量的测定

称取5片VB2药片，之后进行研磨，取10mg，于100ml容量瓶中，溶解，摇匀，移1ml置于100ml容量瓶中，加蒸馏水置刻度线，放入水浴锅加热到35摄氏度，用pH试纸进行测定，确定其pH为7，后移3ml置于10ml带塞比色管中，加蒸馏水置刻度线。

之后进行测定。

3实验结果与讨论

3.1VB2的荧光光谱

图3-1维生素B2的荧光光谱

按照实验方法进行测定维生素B2荧光光谱。

结果如图3-1所示，最大发射波长为530.8nm。

（第一个峰为倍频峰，其产生原因是光栅的二级衍射）

3.2温度对荧光强度的影响

表3-1温度与荧光强度

浓度

0.1ug/ml

0.2ug/ml

0.3ug/ml

0.4ug/ml

0.5ug/ml

0.6ug/ml

16.88

32.91

49.09

66

87.49

105.6

16.52

31.22

47.84

62.63

76.69

94.17

16.09

31.82

48.37

65.03

77.93

97.13

荧光强度（A.U.）

浓度（ug/ml）

）

荧光强度

图3-2不同温度对于实验测定的影响程度对比图

25、35、45℃下荧光强度与维生素B2浓度的图像如图3-2所示，可看出在低浓度（0.1ug/ml至0.3ug/ml）时，温度对于实验的影响较小，在浓度大于0.4ug/ml时，温度对实验的影响开始增大；

可看出35℃的线性关系最好，由此可知25℃与45℃对实验的影响程度较大，而35℃的影响较小；

但这三条曲线相对偏差并不大，可得出温度对于实验的影响较小。

3.3酸碱度对荧光强度的影响

表3-2酸碱度与荧光强度

pH=5

17.22

33.25

53.86

68.66

82.53

101.1

pH=7

17.29

36.39

pH=9

15.35

30.37

49.14

62.62

75.88

92.95

图3-3不同pH对于实验测定的影响程度对比图

pH=5、7、9时荧光强度与维生素B2浓度的图像如图3-3所示，可看出pH=5时，在低浓度（0.1ug/ml至0.4ug/ml）的线性较好，但当浓度大于0.4ug/ml就开始出现了小幅度波动；

当pH=7时，曲线处于小幅度波动状态，但基本还属于线性关系；

当pH=9时，其线性关系在这三条曲线中最好，由此可知pH=9对实验测定影响最小；

但这三条曲线相对偏差均不大，可以得出pH对于实验的影响较小。

3.4阳离子对荧光强度的影响

表3-3阳离子与荧光强度

钠离子

19.17

36.12

55.35

69.35

75.08

93.22

镁离子

18.39

35.15

52.29

75.17

89.05

108.2

荧光强度（A.U）

图3-5不同阳离子对于实验测定的影响程度对比图

当溶液中存在浓度为1.4*10-2mol/L的钠离子与浓度为1.75*10-2的镁离子此时的荧光强度与维生素B2如图3-5所示，可以看出，在低浓度（0.1ug/ml至0.3ug/l）两种离子对于实验的影响程度较小，但在大于0.3ug/ml后，钠离子的影响程度开始增大，虽然镁离子的影响程度也在增大，但其幅度较小；

结果表明存在离子的荧光强度基本与只存在H+离子的荧光强度无异，可以得出低浓度的离子对实验的影响程度较低。

3.5标准曲线

波长（nm）

图3-6维生素B2的荧光光谱

a=0.1ug/ml,b=0.2ug/ml,c=0.3ug/ml,d=0.4ug/ml,e=0.5ug/ml,f=0.6ug/ml

浓度（nm）

图3-7VB2标准曲线

按照上述实验步骤进行测定维生素B2，其浓度与荧光强度有一定的关系，从图3-2中可以看出，浓度越大其荧光强度越强；

根据图3-6的关系可以绘制标准曲线如图3-7所示，从图3-7中可以看出，VB2的浓度与荧光强度呈线性关系，且线性关系良好；

其回归方程为y=187.45x-1.3，R=0.99855。

3.6复合维生素B片中VB2含量测定

图3-8复合维生素B片中VB2荧光光谱图

复合维生素B片中VB2的荧光光谱如图3-8所示。

可以看出在nm=525.8时，取得最大峰值为F=2.149；

将F带入上述标准曲线中得出c=0.022ug/ml；

可以得出VB2的含量是0.00438g/片。

测定结果含量与药品所标注的含量有3%差距，可以得出该药品所标注的含量与实际含量几乎没有差距，含量属实。

结语

维生素B2与碳水，蛋白质，脂肪的转化有关，可以增加生命体对碳水的使用，等等；

如果缺乏维生素B2会导致维生素缺乏症的产生。

此实验就是对复合型维生素B2药品进行荧光分光测定的研究。

首先，确定维生素B2的激发波长，随后确定在不同干扰条件下对实验的影响程度；

在温度为25℃、35℃、45℃的条件下，测定温度对实验的影响程度，可以得出温度对实验的影响效果较小；

在PH为5、7、9的条件下，测定酸碱度对实验的影响程度，可知酸碱度实验的影响效果较小；

在不同阳离子并且其中的钠离子、镁离子浓度分别为1.4*10-2mol/L，1.75*10-2的条件下，测定阳离子对实验的影响程度，可知钠离子的影响程度比镁离子的影响程度强，而氢离子的影响程度最小。

其次，维生素B2的标准曲线的绘制，对一系列的标准液进行测定，绘制出标准曲线。

最后，选择35℃，在PH为7且阳离子为氢离子的条件下，进行药品含量的测定，得出药品中的含量为0.00438g/片，结果与药品所标注的相近。

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