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2013年11月11日

——AdvanceintheresearchofdiagnosisofliverflukeScience

作者：

申博（ShenBo）

摘要：

肝吸虫又名华支睾吸虫，寄生于人和犬、猫等动物的肝胆管内，造成肝胆的一系列疾病，是一种重要的人兽共患寄生虫病。

华支睾吸虫成虫轻度感染不会产生明显临床症状，使患者长期带虫，虫体的分泌代谢产物及虫体本身的机械刺激，对肝胆系统造成慢性损害，可引起胆管炎、胆管肝炎和肝硬化甚至诱发胆管癌等，并具有较强的传染性。

给人类的健康带来较为严重危害。

因此医学工作者对肝吸虫的诊断给予较高的重视，发展了一系列诊断方法包括传统诊断方法以及最新免疫诊断技术。

本文就目前华支睾吸虫各种诊断技术研究进展作一概述。

关键词：

常规诊断、病原原学、影像学、免疫学诊断、

Abstract：

LiverflukeClonorchissinensis,alsoknownasparasiticinhumananddogs,catsandotheranimals,bileduct,causingaseriesofhepatobiliarydisease,isanimportantzoonoticparasiticdiseases.Clonorchissinensisadultswithmildinfectiondoesnotproducesignificantclinicalsymptoms,sothatpatientswithalongworm,thewormandthewormitselfsecretedmetabolitesmechanicalstimulationofthehepatobiliarysystemcausingchronicdamage,cancausecholangitis,hepatitisandbiliarycirrhosisandeveninducedcholangiocarcinoma,etc.,andhasastrongcontagious.Tohumanhealthcausedmoreseriousharm.Therefore,thediagnosisofliverflukemedicalworkerstogiveahigherimportance,thedevelopmentofarangeofdiagnosticmethodsincludingtraditionalimmunologicaldiagnosticmethodsandthelatestdiagnostictechnology.ThisarticleiscurrentlyClonorchisvariousdiagnostictechniquesprovideanoverviewoftheresearchprogress.

Keyword:

Conventionaldiagnosis,Etiology,Pathogen,Immunologicaldiagnosticimaging

前言：

华支睾吸虫病（Clonorchiasis），又称肝吸虫病，是因生食或半生食含有华支睾吸虫幼虫的淡水鱼虾而感染的一种重要的人畜共患寄生虫病。

目前全世界有将近2500万人感染华支睾吸虫，主要分布在东亚和东南亚地区，如中国、朝鲜、韩国、越南及菲律宾等国家。

我国除青海、甘肃、宁夏、内蒙、新疆及西藏外，其余省市均有本病传播或流行。

卫生部于2001年6月至2004年底对部分蠕虫病进行调查的结果显示，华支睾吸虫的人群感染率为2.4%，感染者达1200多万。

由于华支睾吸虫成虫轻度感染不会产生明显临床症状，使患者长期带虫，虫体的分泌代谢产物及虫体本身的机械刺激，对肝胆系统造成慢性损害，可引起胆管炎、胆管肝炎和肝硬化甚至诱发胆管癌等。

对于肝吸虫的诊断与防治得到人们重视。

正文：

肝吸虫病的临床症状有时不够典型，要注意与病毒性肝炎，急慢性胆囊炎，胆结石等相鉴别。

临床诊断，病原学检查是较为常规的方法。

粪便中获取虫卵为确诊依据。

直接涂片法检查虫卵由于取粪便量较少，易被漏查，常用水洗沉淀法集卵。

必要时用十二指肠引流胆汁进行离心沉淀法检查，提高诊断出率。

借助各种高端仪器显微技术进行影像诊断也具有较大的价值。

此外免疫学诊断方法已被广泛引应用，常用的方法有皮内试验、间接血凝实验（IHA）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。

其中，ELISA检查法经过不断改进，具有简便、快速、敏感性高和特异性强的有点，是目前较为理想的方法。

病原学检查

粪检找到华支睾吸虫卵是确诊的根据，一般在感染后1个月可在大便中发现虫卵，常用的方法有：

（1）涂片法：

直接涂片法操作虽然简便，但由于所用粪便量少，检出率不高，且虫卵甚小，容易漏诊。

定量透明法（Kato-Katz，甘油纸厚涂片透明法），在大规模肠道寄生虫调查中，被认为是最有效的粪检方法之一，可用于虫卵的定性和定量检查。

（2）集卵法：

此法检出率较直接涂片法高。

集卵法包括漂浮集卵法和沉淀集卵法两类，沉淀集卵常用水洗离心沉淀法，乙醚沉淀法。

（3）十二指肠引流胆汁检查：

引流胆汁进行离心沉淀检查也可查获虫卵。

此法检出率接近100%,但技术较复杂，一般患者难以接受。

临床上对病人进行胆汁引流治疗时，还可见活成虫，虫体表面光滑，卷缩有蠕动，根据形态特征，可作为诊断的依据。

华支睾吸虫卵与异形类吸虫卵在形态、大小上极为相似，容易造成误诊，应注意鉴别。

免疫学诊断

近年来随着酶、同位素、生物素和胶体金等标记技术和新方法的发展和应用，大大提高了检测血清抗体或抗原的敏感性和特异性，使华支睾吸虫病诊断率大大提高。

目前，在临床辅助诊断和流行病学调查中，免疫学方法已被广泛应用。

常用的方法有间接血凝试验（IHA）、间接荧光抗体试验（IFAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。

1酶联免疫吸附测定

　　（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）酶联免疫吸附测定（ELISA）是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

自20世纪70年代后期出现以来，经过不断的改进和完善，该法已成为十分成熟的免疫学诊断。

Lee等用重组Clonorin作诊断抗原，ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性，IgG抗体的敏感性较低，但特异性达100%。

鉴于重组Clonorin极高的抗原特异性，可作为抗原“鸡尾酒”组分，用于华支睾吸虫感染早期的血清学诊断。

何丽洁等[4]以重组华支睾吸虫26kDaGST蛋白（rCs26GST）为免疫诊断抗原，用ELISA法检测了30份华支睾吸虫病人血清、15份肺吸虫病人血清、20份日本血吸虫病人血清、40份无寄生虫感染的健康人血清，结果华支睾吸虫感染者血清IgG的阳性检出率为73.3%，健康人、肺吸虫病和日本血吸虫病人的阳性率分别为7.5%、20.0%、15.0%。

表明以rCs26GST抗原为免疫诊断抗原的ELISA具有较高的敏感性和特异性，可用于组合“鸡尾酒”式的复合诊断抗原。

Zhao等用7ku蛋白（来自华支睾吸虫排泄/分泌物，公认为活动性华支睾吸虫病的标志性诊断抗原）为包被抗原，ELISA法检测华支睾吸虫病和其他蠕虫病患者血清，敏感性达81.3%，特异性达92.6%。

崔香淑等分别以华支睾吸虫成虫粗抗原和分泌-排泄抗原为免疫诊断抗原，用ELISA法检测华支睾吸虫感染患者509人、麝猫后睾吸虫感染者47人、卫氏并殖吸虫感染者20人、日本血吸虫感染者14人以及健康人163人的血清特异性IgG，检测结果的敏感性和特异性都很高。

为免疫诊断抗原，用间接ELISA法检测检测华支睾吸虫病人血清107份和健康人血清50份，结果可溶性抗原的敏感性和特异性分别为58.88%、98%，符合率为71.34%;

排泄-分泌物抗原的敏感性和特异性分别为87.85%、100%，符合率为91.72%。

　　酶联免疫吸附试验具有高度的敏感性和特异性，操作简便，不需特殊仪器设备，血样用量少，判断结果容易，现场应用方便，是目前符合现场需要的较好的免疫诊断方法。

在经典ELISA的基础上，又有许多改进的方法，如dot-ELISA、ABC-ELISA、McAb-ELISA、G-ELISA、SPG-ELISA等方法。

　　1.1斑点ELISA（dot-ELISA）

　　dot-ELISA是以硝酸纤维素膜为载体，其吸收抗原稳定，不需特殊仪器，操作周期短，是一种微量、敏感、特异的新方法，适于现场应用。

石裕明等（1992）用葡萄球菌A蛋白代替第二抗体用该方法诊断华支睾吸虫病取得了满意结果，在血清稀释度为1：

40时，实验结果阳性率为93.7%。

黄敏君等（1994）用抗华支睾吸虫成虫抗原的单克隆抗体建立dot-ELISA，检测华支睾吸虫病人血清中的循环抗原，该方法的敏感性为83%，特异性为100%。

　　1.2生物素-亲和素酶联免疫吸附测定（ABC-ELISA）

　　ABC-ELISA技术，即生物素-亲和素-酶结合物技术，20世纪80年代开始已广泛应用于各种免疫学检测。

ABC-ELISA利用生物放大效果，既具有免疫反应的特异性，又比常规ELISA的灵敏度提高数倍。

特别是在用于轻度感染病人低水平抗体的检出时，优越性更明显。

裴福全等[8]采用ABC-ELISA法检测华支睾吸虫感染者（62例）和健康人（38例）血清特异性总IgG及其亚类，华支睾吸虫感染者血清特异性总IgG及其亚类阳性检出率分别为IgG100%，IgG154.8%，IgG279.0%，IgG340.3%，IgG498.4%;

健康人血清特异性总IgG假阳性率7.9%，IgG4假阳性率为0;

表明ABC-ELISA法诊断华支睾吸虫病时具有较高的敏感性。

崔惠儿等[9]分别以重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（CysB）和华支睾吸虫成虫可溶性粗抗原（CAA）为诊断抗原，用ABC-ELISA分别检测112份华支睾吸虫感染血清、56份健康人血清、20份日本血吸虫病血清和10份肺吸虫病血清，结果重组抗原CvsB与成虫粗抗原CAA的敏感性分别为92.9%及94.6%;

其特异性IgG检测阴性率均相同，分别为96.5%、95%及90%。

　　1.3单克隆抗体ELISA（McAb-ELISA）

　　McAb标记效价高，亲和力一致，可提高实验的敏感性和特异性。

YongTS等（1998）用传统的ELISA检测出75%的阳性华支睾吸虫病例，但7.1%的对照和37.5%的并殖吸虫病例为假阳性，而使用单克隆抗体进行ELISA抑制试验，阳性率为77.1%，在对照和并殖吸虫病例中无假阳性。

　　1.4重组链球菌G蛋白ELISA（G-ELISA）

　　裴福全等[10]（2007）用重组链球菌G蛋白建立快速酶联免疫吸附试验（G-ELISA），检测华支睾吸虫病患者、其他寄生虫感染者（日本血吸虫病、肺吸虫病、囊虫病）和健康人血清特异性IgG抗体，结果该方法的敏感性为94%，特异性为97%，表明链球菌蛋白G-ELISA用于华支睾吸虫病血清学诊断具有较高的敏感性及特异性。

等[11]（2008）分别以重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（Cs-CysB）和华支睾吸虫成虫可溶性抗原（CAA）为诊断抗原，用SPG-ELISA检测50份华支睾吸虫感染者血清，结果阳性率均为94.00%，健康人血清50例结果阴性率均为100%;

检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份，交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。

表明以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性，检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。

　　1.5半胱氨酸蛋白酶ELISA

　　半胱氨酸蛋白酶ELISA，是通过检测位于肠内的成虫和子宫体内的卵子中半胱氨酸蛋白酶的报春黄甙，通过ELISA来评价半胱氨酸蛋白酶报春黄甙的效价，此种方法的特异性和敏感性很高。

Pei等[12]（2005）用CysB重组蛋白建立ELISA检测方法，该法的敏感性达96.0%（48/50），特异性达96.2%（25/26），而对比实验中可溶性粗抗原用于检测的敏感性为88.0%（44/50），与其他寄生虫感染者血清无交叉反应。

表明该重组抗原用于ELISA诊断时具有较高的敏感性及特异性。

裴福全等[13]（2008）分别以华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶（CsCp）与成虫粗抗原（CsCAA）为ELISA包被抗原检测华支睾吸虫病流行区人群血清特异性抗体水平，CsCAA-ELISA阳性率75.3%，rCsCP-ELISA阳性率76.3%，CsCAA-ELISA、rCsCP-ELISA结果与粪检结果的符合率分别为56.7%和55.7%，两种抗原ELISA结果的符合率为82.5%。

59例粪检阳性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率均为76.3%，38例粪检阴性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率分别为73.7%和76.3%。

结果表明以rCsCP和CsCAA为包被抗原，用ELISA法检测华支睾吸虫病人血清特异性IgG抗体时具有较高的符合率。

　　2免疫胶体金检测

　　1971年Faulk和Tayto将胶体金引入免疫化学[14]，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。

吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、糖蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白、酶、激素、抗生素等各种大分子和小分子物质非共价结合，因此在临床试验和基础研究中成为非常有用的工具。

当这些胶体金标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

目前在医学检验中应用的免疫胶体金技术主要是斑点免疫金银染色法、免疫金渗滤法和免疫层析检测（ICT）试剂盒。

　　2.1斑点免疫金银染色法（IGSS）

　　斑点免疫金银染色法是将Dot-ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。

将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点。

LiuY等（2001）用dot-IGSS检测35例确诊华支睾吸虫病患者的血清，均为阳性反应，血清抗体平均效价为1：

1656，表明dot-IGSS具有很高的特异性和敏感性。

　　2.2快速斑点免疫金染色法（R-Dot-IGS）

　　吴胜吉等[14]97用R-Dot-IGS法、IFAT法和ELISA法同步检测83份华支睾吸虫病患者血清，75例健康人血清和10例日本血吸虫病人血清。

三种方法的阳性率分别为98.79%、96.38%和97.59%;

检测75例健康人血清结果均为阴性：

检测10例日本血吸虫病人血清，有1份日本血吸虫病人血清在IFAT反应为阳性。

表明R-Dot-IGS法具有敏感特异、快速简便等优点，适用于华支睾吸虫病的现场流行病学调查和临床快速诊断。

　　2.3斑点金免疫渗滤法（DIGFA）

　　斑点金免疫渗滤法是近年来发展的以胶体金为非酶标记物的快速斑点免疫结合试验，胶体金是负电荷的疏水胶，其负电荷是散在存在的，直径从几纳米到十几纳米不等，成橘红色。

该法的原理和实验过程与两点的ELISA相同，差别仅在于加样、反应和洗涤均通过渗透完成。

刘登宇等[15]以华支睾吸虫成虫抗原为包被抗原，金标记葡萄球菌A蛋白（SPA）为显色剂，检测血清抗体，用dotELISA作平行对照，患者血清阳性率分别为96.6%和92.4%，两者的敏感性相近。

而DIGFA检测猪囊尾蚴患者血清20例、日本血吸虫病患者血清25例、健康者血清40例，前两者的交叉反应率分别为5%和4%，后者均为阴性。

　　2.4胶体金免疫层析检测（ICT）试剂盒

胡旭初等[16]以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶（PGK）作为诊断试剂,制备胶体金免疫层析检测试剂盒，检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫IgG，并与常规ELISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。

实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的IgG，3种抗原的敏感性均为100%。

天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外，与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。

重组PGK抗原同慢性血吸虫病人血清也没有交叉反应。

用分泌排泄抗原制备的ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液,总符合率为92.31%;

ICT与ELISA血清检测的总符合率为81.54%。

现场获取了9人的粪便样本，其中4人检出华支睾吸虫卵,其血清ICT和ELISA检测均呈强阳性,另外未检出虫卵的5人中，1人血清ICT和ELISA均呈阳性，另1人仅血清ELISA呈弱阳性。

证明诊断华支睾吸虫感染的ICT抗体检测技术，尤其是无创性唾液检测技术，简便、快速、准确、安全，优于血清ELISA检测和粪便虫卵检测，适用于临床检验和现场大规模流行病学调查。

华支睾吸虫病免疫学诊断方法具有客观、操作简便等优点，有取代传统诊断方法的趋势，但另一方面这些方法也存在着假阴性、假阳性及交叉反应等不足。

目前，用于免疫学诊断的重组抗原，检测结果显示特异性较高，但敏感性较低，所以找到具有更高特异性、高敏感性、更稳定、制备方法更简单的诊断抗原并改进免疫学诊断方法是今后一段时期本领域研究的重点所在。

影像学诊断

B型超声波检查法

用B型超声波检查华支睾吸虫病患者时，在超声像图上可见多种异常改变，如肝内光点粗密欠均，有斑点状、团块状或雪片状，弥漫性中小胆管不同程度扩张、胆管壁粗糙、增厚，回声增强或胆管比例失常及枯枝状回声。

尽管声像图特异性不强，但与流行病学、临床表现及实验室检查对比分析，仍具一定诊断价值。

超声波诊断法

肝血吸虫的声像图表现为参考依据;

超声表现：

肝脏大小形态正常，包膜光滑，表面光滑，肝缘锐利，肝实质回声稍增强，实质内不均匀的数量不等的斑片状、条索状稍高回声区，似繁星密集分布，部分呈“小雪花征”，边界清楚，肝内胆管壁节段性回声增厚增强，形成特征性的节段性多发“等号状”或“短棒状”强回声，伴远端小胆管扩张[3]，部分患者肝内胆管可见类圆形强回声，后方无声影，造成梗阻以上胆管有不同程度的增宽或局限性扩张，胆管分支增多;

胆囊形态增大，壁稍增厚，囊内可见点状强回声沉积物，探头加压探查或变换体位可见其漂移，似雪花飘落状，此特征性表现为肝吸虫病超声表现的有力佐证。

依据肝脏声像图特征，结合吃生鱼片病史，就可以对其作出诊断，为患者早期治疗提供依据。

CT检查法

CT检查对华支睾病诊断也有较大价值。

有资料报道，在CT照片上，华支睾吸虫胆道感染具有以下特征：

肝内胆管从肝门向周围均匀扩张，肝外胆管无明显扩张；

肝内管状扩张胆管直径与长度比多数小于1:

10；

被膜下囊样扩张小胆管以肝周边分布为主，管径大小相近，这些是特异性征象；

少数病例胆囊内可见不规则组织块影。

因此认为CT是本病较好的影像学检查方法。

总结

随着科学技术的发展，医疗技术的长足进步，各种高科技医疗设备的不断更新。

肝吸虫的诊断技术也得到了较快的发展，在运用传统的诊断技术病原学检查法临床的初步诊断的同时配合影响诊断学技术以确保诊断的准确性。

而免疫学诊断方法具有客观、操作简便等优点，有取代传统诊断方法的趋势，但另一方面这些方法也存在着假阴性、假阳性及交叉反应等不足。

相信在医务工作者的努力下，和患者对各种寄生医学科普知识的了解，一定能减少寄生虫人们的健康的危害。

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