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《注射剂2008’新法规解析及应对方案系列培训班》

注射制剂无菌保证

工艺技术要求的探讨

注射制剂无菌保证工艺技术要求

一、前言

二、

三、二、注射剂基本技术的要求

四、

五、三、无菌保证工艺研究与验证要求

六、

七、四、无菌药品生产关键工艺的法规要求

八、

九、（以最终湿热灭菌药品工艺为例）

十、

一、前言

1970年~1975年，美国因输液污染所导致的并发败血症事件有400多起，这在美国国内引起强烈的反响。

FDA从1975年开始进行了深入、广泛的调查，发现这些事件并不是出于企业违规生产，而是整个生产体系中的不稳定因素所致。

此后，FDA于1976年首次将验证列入GMP。

承认在无保证系统中，过程控制优于结果检验。

30多年过去了，注射剂染菌所致的药难事件降临我国，“欣弗”事件使得无菌制剂的无菌保障问题成为公众关注的焦点。

--------无菌检查的局限性

--------研究无菌保证的途径

面临的主要问题

剂型选择不合理

无菌保证工艺选择不合理

无菌保证工艺研究不全面

无菌保证工艺缺乏必要的验证

GMP与发达国家要求还存在差距

《整顿和规范药品研制、生产、流通秩序工作方案》（国食药监办〔2006〕465号）要求:

严格审评审批化学药品注射剂、中药注射剂和多组分生化注射剂等安全性风险较大的3类品种。

十一、注射剂基本技术的要求

审评审批要求:

一、国家局已受理但尚未批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂应参照《技术要求》进行研究。

二、已经批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂也应参照《技术要求》进行相关研究，并在申报再注册时提供相关研究资料。

三、对已上市化学药品注射剂、多组分生化药注射剂进行仿制、改变剂型或者改变给药途径研究时，研究者应当慎重考虑已上市品种的研究基础。

以化学药品注射剂为例:

一、化学药品注射剂剂型选择的必要性、合理性

二、化学药品注射剂规格的合理性、必要性

三、化学药品注射剂原、辅料质量控制及来源

四、化学药品注射剂处方及制备工艺合理性、可行性研究，特别是灭菌工艺的选择及验证研究、工艺稳定性研究等

五、化学药品注射剂质量研究及质量标准制订

六、化学药品注射剂稳定性研究

七、化学药品注射剂非临床安全性评价的技术要求

八、化学药品注射剂临床研究技术要求

九、仿制化学药品注射剂的技术要求

十、化学药品注射剂说明书和标签内容的技术要求

本讲座主要探讨无菌保证工艺研究及评价

包括：

制备工艺的选择

工艺参数的确定

工艺的验证

注射剂灭菌工艺及其验证

三、无菌保证工艺研究与验证要求

1.最终灭菌产品的无菌保证水平规定为:

2.微生物污染概率不超过百万分之一

3.

4.2.采用无菌生产工艺的产品:

5.其无菌保证水平为微生物污染概率不超

6.过千分之一

7.3.与产品无菌保证相关的影响因素

8.环境

9.厂房、设备

10.原材料（原辅料、包装材料）

11.无菌保证工艺

12.生产过程控制

13.人员卫生

14.4.灭菌方法选择按欧盟1999年8月正式开始执行灭菌方法选择的决策树

15.决策树的作用是在考虑各种复杂因素的情况下辅助选择最佳的灭菌方法

16.凡是可以最终灭菌的产品务必要最终灭菌

17.

18.

19.决策树越往下，风险越大

20.需要提供的必要证据越多

21.5.基本原则:

22.无菌产品应在灌装到最终容器后进行最终灭菌（首选）

23.如因产品对热不稳定不能进行最终灭菌时，可采用最终灭菌方法的替代方法----过滤除菌和/或无菌生产工艺（退而求其次）

24.

25.同时明确如下要求：

26.无菌药品生产企业，首先应根据特定的处方选择最佳的灭菌方法，然后再选择包装材料

27.使用热不稳定的包装材料不能作为选择无菌生产工艺的理由

28.因其他因素选择的包装容器不能进行最终灭菌，药品生产企业仍有责任不断寻找可接受的替代容器，使得产品可以在可接受的时间范围内采用最终灭菌的方法

29.任何商业考虑均不能作为不使用具有最高无菌保证水平的最终灭菌方法的理由

30.常用的灭菌方式及其无菌保证水平

31.1、过度杀灭法

32.微生物残存概率＜10-6

33.2、残存概率法

34.微生物残存概率＜10-6

35.3、无菌生产工艺

36.无菌保证一般只能达到10-3水平

37.

38.最终灭菌工艺的验证要求

39.最终灭菌工艺：

40.过度杀灭法（Fo≥12）

41.残存概率法（8≤Fo＜12）

42.

43.目标：

灭菌后的微生物残存概率＜10-6

44.过度杀灭设计方法：

45.一种灭菌设计方法，只需要最少的关于产品生物负载的信息。

最差条件的生物负载猜测用来确定所产生的杀灭力需要获得灭菌物上的PNSU为10-6。

在使用这个方法时，确效计划必须证明FBIO和FPHY都大于12分钟。

46.

47.残存概率法：

48.一种灭菌设计方法，当所产生的杀灭力需要达到PNSU为10-6时，以（灭菌物品上或内的）生物负载的特性和产品对热的敏感度为基础。

49.

50.应产品而定的设计方法

51.工艺验证要求：

52.过度杀灭法和残存概率法均应进行工艺验证

53.验证内容：

空载热分布

54.满载热分布

55.热穿透试验

56.微生物挑战试验（残存概率法）

57.灭菌前微生物污染水平---数量和耐热性

58.---过程控制

59.

60.热力灭菌的动力学原理

61.

62.微生物耐热参数——（D值）

63.温度系数——Z值

64.FT值——T℃灭菌时间

65.F0值——标准灭菌时间

66.无菌保证值（SAL）

67.灭菌率L

68.对数规则：

Arrhenius质量作用定律

69.湿热灭菌的对数规则始于1921年Bigeow发表的论文---用对数规则阐述灭菌工艺过程，他认为，灭菌过程可以用阿伦尼乌斯的一级反应式来描述。

根据质量作用定律，在恒定温度及保持其它条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0时原有的数目，即：

70.dN/dt＝K（N0－Nk）

71.式中：

N0为t＝0时，存活的微生物数；

72.Nk为t时被杀灭的微生物数；

73.N为t时存活的微生物数。

74.由此得出，灭菌时微生物的死亡遵循对数规则。

75.微生物存活数与灭菌时间关系图

76.微生物耐热参数（D值）:

77.

78.D值是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所需要的时间（分钟）。

79.

80.灭菌温度系数（Z值）:

81.Z值系指使某一种微生物的D值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数.

82.在没有特定要求时:

83.湿热灭菌条件下Z值通常取10℃；

84.干热灭菌条件下Z值通常取20℃；

85.干热去热原时Z值通常取54℃。

86.FT值——T（℃）:

87.灭菌时间FT值指T（℃）灭菌值，系指一个给定Z值下，灭菌程序在温度T（℃）下的等效灭菌时间。

88.FT＝DT×

ΔlgN

89.式中:

90.DT为在T（℃）下微生物的D值；

91.ΔlgN为T（℃）下灭菌程序使微生物数下降的对数单位数。

92.F0值:

93.标准灭菌时间（用于湿热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在121℃下的等效灭菌时间（分钟）。

94.FH值:

95.标准灭菌时间（用于干热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在170℃下的等效灭菌时间（分钟）。

96.灭菌率L：

97.L指在某一温度T（℃）下灭菌lmin所获得的标准灭菌时间。

98.L=10（Ti-TR）/Z

99.Ti——灭菌温度

100.TR——标准参照温度

101.Z——微生物死亡率常数

102.

103.

104.微生物挑战试验

105.微生物挑战试验

106.生物指示剂--简称为BI（biologicalindicator）:

是对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，适用于制备生物指示剂的微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规的生长态微生物对灭菌工艺具有更强的耐受性。

生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。

107.

108.微生物挑战试验

109.所谓湿热灭菌工艺的生物指示剂微生物挑战试验，系指将一定量已知D值的耐热孢子接入被灭菌的产品中，在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能赋予产品所需的SAL为10－6而进行的试验及评价过程。

110.

111.微生物挑战试验

112.USP和BP对这方面有专门的论述。

一般说来，对生物指示剂选择的原则性要求是：

113.——孢子（菌株）稳定

114.——耐热性强于被灭菌物品中常见的污染菌

115.——系非致病菌

116.——易于培养，孢子萌发率要在90%以上

117.——有效期长

118.——保存及使用方便

119.——安全性好

120.

121.微生物挑战试验

122.湿热灭菌工艺验证用生物指示剂的来源主要有两类:

123.一类是采用标准生物指示剂，这类生物指示剂可从市场购买；

124.另一类需用从日常生产污染菌监控分离出的最耐热微生物孢子制备，并测得相关参数（最佳生长条件、耐热性等）后方可使用。

125.

126.湿热灭菌工艺验证中常用的生物指示剂

127.菌种名称常规D121℃值/min

嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstereathernophilus1.5～3.0

枯草芽胞杆菌BacillussubtilisATCC52300.3～0.7

凝结芽胞杆菌Bacilluscoagulans0.4～0.8

梭状芽胞杆菌Clostridiumsporogenes0.4～0.8

例:

国产非治病性嗜热肪芽胞菌芽胞（ATCC7953）

D值-------------D121值1.74

存活时间------121oC饱和蒸汽下,存活时间不

少于3.9分钟

死亡时间------121oC饱和蒸汽下,死亡时间不

少于19分钟

孢子量----------5×

105-6cfu/支

16使用方法:

将生物指示剂和被灭菌物品一起放置在灭菌柜（锅）内，上、中层、中央和排气口（冷点处）灭菌后取出，然后直接置于56–60oC培养24–48小时，并另取一支未经灭菌生物指示剂一起培养，作为阳性对照。

结果判断:

根据颜色判断灭菌效果，培养后全部保持紫色灭菌合格。

若由紫色变为黄色判为灭菌不合格。

对照管应紫变黄色为该指示剂有效。

进口3MTMATTESTTM（1262）蒸汽灭菌生物培养指示剂（嗜热脂肪杆菌芽胞菌片）

在121℃饱和蒸汽条件下，存活时间大于或等于5分钟，杀灭时间小于或等于15分钟。

灭菌完毕，取出生物指示剂后至少冷却10分钟以上，方可挤破生物指示剂内安瓿。

否则有可能导致安瓿的碎片伤人。

只有对照管为阳性，其生物结果才算有效。

使用方法

1、将压力蒸汽灭菌生物培养指示剂放于一标准测试包中；

2、按照国家规范，分别将测试包放于锅内不同位置；

3、灭菌完毕，取出生物指示剂；

4、挤破内含的安瓿，与一支对照管一起放于56℃培养锅培养；

5、48小时后，阅读结果。

微生物挑战试验

挑战试验合格标准

生物指示剂的选用应构成挑战性的必要条件：

可用药典，如USP<

1035>

中规定的生物指示剂；

对存活概率灭菌程序的产品而言，应当强调，所用生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性，生物指示剂的用量也应大于产品中该污染菌的水平。

经生物指示剂验证后，应能证明在设定的F0条件下，产品的无菌保证水平低于10-6。

方案制订

制订验证方案时，应当综合考虑相关法规要求、灭菌热分布及热穿透试验数据、产品的热稳定性、日常生产监控中所获得的灭菌前产品中的微生物污染水平和污染菌的耐热性数据。

方案还包括验证记录的各种表格。

湿热灭菌程序通常分为两类：

过度杀灭程序（OverkillDesignApproach）

残存概率程序（Product-SpecificDesignApproach）

挑战试验（生物指示剂验证试验）:

生物指示剂的装载

灭菌

检查和培养

结果评价

验证试验的频率

作为一项生物挑战性试验，尽管生物指示剂验证不能替代物理验证，但它能如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。

生产指示剂在试验中扮演了各种可能因素造成的产品中的“污染菌”的角色，以这种方式进行的验证更切合实际，更能说明所设定的灭菌程序是否安全。

对热稳定性很好的产品而言，通常采用过度杀灭程序，该程序能赋予产品足够大的安全系数，使在121℃下D值约为1.0min的细菌孢子至少下降12个对数单位。

在过度杀灭程序的一半时间时，可使该孢子至少下降6个对数单位。

由于杀灭微生物孢子（生物指示剂）的灭菌条件极为苛刻，因此，从灭菌程序的标准灭菌时间F0来看，毋须担心产品灭菌后的无菌保证问题。

并不是所有的灭菌程序都可进行生物指示剂验证。

有些产品的热稳定性相当差，灭菌温度仅能控制在100℃左右，整个灭菌程序的F0值还不到1min，对此类程序进行生物指示剂验证就没有太多的意义。

此类产品的无菌保证水平主要是通过无菌生产工艺来实现，灭菌仅能作为提高产品无菌保证水平的手段。

WHOGMP中强调，化学或生物指示剂可用于灭菌过程的监控，但不得代替物理监控（温度、时间）。

FDA均认为生物指示剂验证并不能取代物理验证，这是由生物指示剂验证的复杂性所决定的。

DryheatsterilizationDvalueis

F值的数学表达式如下：

Z值是指灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需提高的

温度。

1..将指示剂与待灭菌的物品一同放入灭菌器内，一同灭菌。

2.灭菌结束后，取出指示剂，待冷却（约15分钟）后，将盖子按下以密封塑料管。

3.用所提供的工具挤压塑料管，使安培瓶破裂，培养基溢出，与纸片接触。

4.置于56摄氏度培养，定时观察生长情况

5.48小时内出结果

在湿热灭菌时，参比温度定为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃时，Z值为10℃。

2、什么是化学灭菌法，分为哪几类，有何应用特点？

答：

化学灭菌法系指用化学药品杀死微生物的方法。

化学灭菌法分为：

①气体灭菌法：

有环氧乙烷、臭氧、过氧乙酸、甲醛、丙二醇、乳酸等。

以环氧乙烷最为常用。

气体灭菌法用于塑料容器、玻璃制品、金属制品等表面，设备表面，室内空气的灭菌，也可用于包装纸箱，注射针、筒，衣着敷料，纸或塑料包装的药物的灭菌。

②化学灭菌剂灭菌法：

常用的有0.1％~0.2％的新洁尔灭溶液，2％左右的酚或甲酚皂液，75％的乙醇液等。

主要作为物体表面，无菌室墙面、地面、台面等的消毒。

17、物理灭菌法可分为哪几类，各有何应用特点？

物理灭菌法可分为干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤灭菌法。

射线灭菌法。

1）干热灭菌法是一种利用干热空气进行灭菌的方法。

分为火焰灭菌法和干热空气灭菌法，火焰灭菌法适于耐火焰材料的灭菌，如金属、玻璃及瓷器等。

干热空气灭菌法适于耐高温的玻璃器具、金属容器、耐高温的药物粉末及不允许湿气穿透的油性物质（如油脂性软膏基质、注射用油等）的灭菌，不适于橡胶、塑料及大部分药品。

2）湿热灭菌法分为热压灭菌法、流通蒸气灭菌法、煮沸灭菌法和低温间歇灭菌法。

热压灭菌法时湿热灭菌中最可靠的方法，适用于耐热压灭菌的药物、玻璃器皿、金属容器、瓷器、橡胶塞、滤膜过滤器、医院手术用品等的灭菌。

流通蒸气灭菌法与煮沸灭菌法均不能保证杀死所有的耐热芽孢，适用于必须加热灭菌，但不耐高温的药物。

低温间歇灭菌只能杀死繁殖体，适于不耐高温的药物，灭菌效果不可靠，需另加抑菌剂。

3）射线灭菌法分为紫外灭菌法、辐射灭菌法和微波灭菌法。

紫外灭菌法对细菌繁殖体与芽孢均有杀灭作用，仅用于空气及表面的灭菌。

辐射灭菌法穿透力强、灭菌效力高，适于不耐热固体药物与药用材料的灭菌。

微波灭菌法灭菌迅速、加热均匀、操作简单。

4）过滤除菌法是用过滤的方法除去活的或死的微生物得到无菌滤液的一种方法，适于不能加热灭菌的药液、气体、水等的灭菌。

4、验证热压灭菌法可靠性的参数是是

A.F0值B.Z值E.D值D.F值

答案[A]

4、灭菌法：

答案：

系指杀死或去除所有微生物的繁殖体和芽孢的方法。

5、防腐：

系指用物理或化学方法抑制微生物生长繁殖。

6、消毒：

系指用物理或化学方法杀死或去除病原微生物。

8、D值：

系指在一定温度下，将微生物杀灭90％以上或使之降低一个对数单位所需的时间。

9、Z值：

系指降低一个1gD值需升高的温度值，即灭菌时间减少为原来1/10所需要升高的温度数。

10、F值：

系指在一定温度（T）下给定Z值所产生的灭菌效果与T0下给定Z值所产生的灭菌效果相同时所相当的灭菌时间，单位为分钟。

10、F0值：

系指一定灭菌温度（T）下、Z值为10℃产生的灭菌效果与121℃、Z值为10℃产生的灭菌效果相同时所相当的灭菌时间。

4、当湿热灭菌的F0值大于，微生物残存率小于10-6，可认为灭菌效果可靠。

答案[8]

13、紫外线的穿透力弱，仅适用于物体的灭菌和的灭菌。

答案[表面；

无菌室空气]

28、D值是微生物的耐热参数，D值越，说明该微生物耐热性越。

答案[大；

强]

31、湿热灭菌法包括法、法、法和法，其中效果最可靠的是法，该法灭菌的一般条件是115.5℃、30分钟。

答[热压灭菌；

流通蒸汽灭菌；

煮沸灭菌；

低温间歇灭菌；

热压灭菌]

44、热压灭菌所用的蒸汽应该是

A.过饱和蒸汽B.过热蒸汽C.流通蒸汽D.饱和蒸汽

答案[D]