棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察Word格式.docx

棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察Word格式.docx

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张献龙，男，教授，博士生导师。

E-mail:

xlzhang@

Histo-cytologicalObservationofSomaticEmbryogenesisinCotton（GossypiumhirsutumL.）

CaoJing-lin,ZhangXian-long,YangXi-yan,DengFeng-lin,TanJia-fu,HaoJuan

（NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement,HuazhongAgriculturalUniversity,430070,Wuhan,Hubei,China）

Abstract：

CalliwereinducedfromhypocotylexplantsofcottoncultivarCoker201,andindividualembryogeniccellclusterswith30–50meshsieve,whichisolatedfromembryogenicsuspensioncultures,werecultured.Thedevelopmentofthecalliandsinglefew-celledaggregateswasobservedthroughparaffinsections.Theresultsrevealed5pathwaysofembryogeniccallioriginationincludingoriginationfrombothendsofhypocotyls,originationininner,differentiationfromnon-embryoniccells,originationfromoutercellsofcalli,andoriginationinthesurroundingofgland.Amongthese,theoriginationfrombothendsofhypocotylsandininnerwerethemostimportantpathways.Cottonsomaticembryosoriginatedfromindividualembryogeniccells,whichwereinexteriorofembryogeniccalliinmostcases.Themostcriticaleventsappearedtobetheestablishmentofapical-basalpatternsofsymmetry,formationofapicalmeristems,anddifferentiationandaxialchangeofprocambiumduringthedevelopmentofcottonsomaticembryos.Differentiationoftheprotodermlayermarkedthebeginningofthestructuraldifferentiationinglobularstage.Incipientprocambiumformationwasthefirstsignofsomaticembryotransition.Axialelongationofinnerisodiametriccellsoftheglobularsomaticembryofollowedbythechangeinthegrowthaxisoftheprocambiumwasanimportanteventinheart-shapedoroblong-stagesomaticembryo.Vacuolationinthegroundmeristemoftorpedo-stageembryobegantheprocessofhistodifferentiation.Histologicalobservationsofsomeglobularandtorpedo-shapedembryoswhichfairedtoadvanceshowedthatestablishmentofpolaritywasthekeyfactorwhichdeterminedgerminationofsomaticembryos.

Keywords:

Cotton;

Somaticembryogenesis;

histo-cytology

体细胞胚胎发生是指与原始组织不存在微管束联系的非合子细胞发育成一个类似合子胚的极性结构的过程[1,2]，它经历了与合子胚发生类似的关键阶段：

球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶成熟胚[1]。

这个过程也是展示植物细胞如何首先分化然后重新决定向胚性途径发展而呈现全能性的一种方式[1]。

作为20世纪后期植物组织培养中的一个重大发现和突破，体细胞胚胎发生体系在植株再生、病毒脱除、细胞融合、基因工程等领域中具有广泛的应用。

然而，由于不同物种，甚至同一物种的不同基因型在体细胞胚诱导、体细胞胚的同步发育以及体细胞胚的成熟等各方面对培养条件的要求不同，而使其潜力难以充分发挥。

近年来，棉花体细胞胚胎发生和再生技术得到了明显改进[3-5]，但对棉花体细胞胚胎发生机制的研究较少[6,7]。

棉花的再生过程主要是通过诱导愈伤组织产生体细胞胚,由体细胞胚发育成再生苗。

在此过程中了解愈伤组织和体细胞胚的发生及生长过程对研究棉花体细胞胚的发生机理及进一步改进再生体系有很大帮助。

目前，尽管有一些关于棉花体细胞胚胎发生过程的显微观察报道[6,8-11]，但系统的组织学研究报道尚未见到。

因此，本研究采用石蜡切片技术，研究体细胞胚的发生特征，以期从细胞学水平上认识体细胞胚的发生特点，为进一步提高再生效率研究提供依据。

1材料与方法

1.1愈伤组织的诱导和继代培养

以陆地棉品种Coker201为供试材料，由华中农业大学棉花育种室提供。

棉花品种Coker201的成熟种子经去壳消毒后，种植在1/2MS培养基上，于28±

1℃下暗培养7d左右，获无菌苗。

取无菌苗下胚轴切成0.5cm左右的小段，平放于愈伤诱导培养基（MS无机盐，B5有机物，0.45µ

mol·

L-12,4-D，0.46µ

L-1KT，0.1%（w/v）MgCl2·

6H2O，3%（w/v）glucose）上。

诱导35d左右将愈伤组织转移到2,4-D减半的愈伤诱导培养基上继代培养。

以后每28d继代1次，直至愈伤组织发生肉眼可见的胚分化。

把胚性愈伤组织转入分化培养基（MS无机盐,无NH4NO3而KNO3加倍，B5有机物，2.46µ

L-1IBA，0.70µ

L-1KT，0.1%（w/v）Glu，0.1%（w/v）Asn，3%（w/v）glucose），每28d继代1次。

愈伤的诱导和分化培养于28±

2℃，光照强度（冷光源）135µ

m-2·

s-1，每天光照14h的条件下进行。

每两天取一次样放入FAA固定液中固定以供组织分析。

1.2胚性愈伤组织的悬浮培养

胚性愈伤组织继代培养2～3次后，转入不含激素和Phytagel的分化培养基（补加0.1%（w/v）KCl）中悬浮培养。

首先选取生长稳健、状态疏松的小米粒状米黄色胚性愈伤组织转入盛有40mL培养基的100mL锥形瓶（约2g/瓶）中，温度28±

2℃、120rpm振荡培养2d，以获得分散的细胞培养物，然后过30目筛，去除大颗粒。

然后将每2mLPCV（packed-cell-volume）胚性愈伤转入盛有40mL新鲜培养基的锥形瓶中，继续在温度28±

2℃下，120rpm振荡避光培养。

每周更换悬浮培养液1次。

1.3胚性细胞团的固体培养

胚性愈伤组织悬浮培养14d后，再次过30目筛，滤液再过50目筛，收集筛上部分，重新悬浮于新鲜培养基中，用一个长而尖嘴的吸管吸取含愈伤组织的悬浮液均匀喷布在无菌滤纸上。

然后挑取单个的胚性愈伤团转到培养皿中的固体分化培养基（附加2.46µ

molL-1IBA，0.70µ

molL-1kinetin和0.1%（w/v）KCl）上继续培养。

继代后用封口膜密封，然后于28±

2℃、光照强度（冷光源）135µ

m-2·

s-1、每天光照14h的条件下进行培养。

每皿继代20个胚性愈伤团。

每两天取样1皿于LeicaMZFLШ体视显微镜下检查胚胎发育进程，并在不同发育阶段取培养物按愈伤团分别放入FAA固定液中固定以供组织分析。

每个阶段开始前后每2d取样一次固定，缓慢阶段5d取样一次固定。

1.4石蜡切片制样与观察

将待观察的组织取样后放入FAA固定液（福尔马林（formalin）:

乙酸（aceticacid）:

乙醇（alcohol）=5:

5:

90）[1,2]中，室温下固定48h以上。

将固定好的组织投入苏木精染液中，染色3d后用蒸馏水漂洗过夜。

然后通过以下浓度梯度的乙醇进行脱水：

30%3h，50%3h，70%3h，85%3h，95%1h，100%30min，100%30min。

接着进入以下浓度梯度的二甲苯进行透明：

30%（二甲苯/氯仿）2.5h，50%2.5h，75%2.5h，100%1h，100%1h。

然后再在以下梯度浓度的石蜡中浸蜡：

15%（石蜡/二甲苯）3h，30%3h，50%2.5h，75%2.5h，100%50min，100%50min，最终包埋在100%的石蜡中。

包埋好的组织用旋转切片机（KD2508,KEDEE,China）切成10μm厚的连续切片，封片后进行组织学观察。

切片在显微镜（DM2500，Leica，Germany）下观察并照相。

2结果与分析

2.1愈伤组织诱导和分化过程的组织细胞学观察

棉花下胚轴外植体（图1-A）在培养的第3天就能观察到两端开始膨大,切口处开始有愈伤组织形成（图1-B1、B2），石蜡切片观察表明，这些愈伤组织是由胚性细胞和非胚性细胞组成的（图1-B1、B2），这说明二者有可能是同时产生的。

纵切面观察还表明，切口形成层处有胚性细胞形成（图1-B2），说明两端产生的胚性细胞可能来自于形成层，而非胚性细胞是由皮层细胞分化形成的。

到第5天能够观察到皮层细胞进一步膨涨，分化形成大量的非胚性愈伤组织（图1-C1）。

这些非胚性愈伤组织迅速扩增繁殖，将胚性细胞组成的胚性愈伤组织包裹在愈伤组织内部，但仍有少量的胚性细胞裸露在愈伤组织表面（图1-C2、C3）。

组织学观察表明，非胚性愈伤组织的细胞形态大而不规则，细胞核小、位于细胞边缘，细胞质稀薄，细胞壁薄，细胞含水量大，往往会因为制样过程中的脱水作用而变形。

胚性愈伤组织结构比较致密,细胞核大，体积较非胚性细胞小，排列紧密（图1-C2、C3）。

随后，下胚轴整个小段的皮层细胞膨涨变软，分化形成非胚性愈伤组织，而两端的胚性愈伤组织细胞以平周分裂方式迅速扩增繁殖，向外推挤（图1-F1、F3），一般在培养27d后，这些胚性愈伤组织就已经能够在愈伤组织表面肉眼可辨（图1-F2）。

观察还发现，愈伤组织也主要以内发生形式形成。

纵切面观察表明，在下胚轴诱导培养5-7d时,整个小段的形成层细胞开始不连续的直接分化形成胚性细胞（图1-D1），这些胚性细胞以平周分裂方式迅速往外扩增（图1-D2），诱导培养9-11d时，可以观察到在优先产生胚性细胞的区域形成一个个的胚性愈伤组织突起（图1-D3）。

横切面观察表明，这些愈伤组织主要在形成层周边的4个两两对称点处分化形成（图1-E1）,这些点处产生的胚性细胞迅速往外分裂扩增，新形成的胚性细胞又迅速向周边分裂扩增（图1-E2、E3），进而沿下胚轴方向形成4个曲曲折折的胚性愈伤组织区域带（图1-D3、E1），这些愈伤组织区域带进一步向外推移，最后推挤到愈伤组织表面，肉眼可见。

图1棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的两端发生和内发生

Fig.1Originationofembryogeniccallifrombothendsofhypocotylsandininnerduringinductionofcallifromhypocotylexplantsofcotton.

A：

诱导当天的下胚轴纵切面；

B1-B2：

诱导第3天下胚轴纵切面；

C1-C3：

诱导第5天下胚轴纵切面；

D1：

D2：

诱导第7天下胚轴纵切面；

D3：

诱导第11天下胚轴纵切面；

E1-E2：

诱导第15天下胚轴横切面；

E3：

内发生胚性愈伤组织突起的横切面；

F1-F3：

诱导第27天下胚轴纵切面。

A:

Verticalsectionofhypocotylonthedayofinitialinduction;

B1-B2:

Verticalsectionofhypocotylonthe3rddayofinduction;

C1-C3:

Verticalsectionofhypocotylonthe5thdayofinduction;

D1:

D2:

Verticalsectionofhypocotylonthe7thdayofinduction;

D3:

Verticalsectionofhypocotylonthe11thdayofinduction;

E1-E2:

Transversesectionofhypocotylonthe15thdayofinduction;

E3:

Transversesectionofprotuberantembryogeniccallioriginatedininner;

F1-F3:

Verticalsectionofhypocotylonthe27thdayofinduction.

石蜡切片观察还表明，在非胚性愈伤组织内部，部分长形或长椭圆形的非胚性细胞通过活跃的有丝分裂活动、快速的细胞分裂和增殖，可以转化为椭圆形、近圆形的胚性细胞（图2-A、B）。

这些胚性细胞进一步分裂，形成胚性愈伤组织细胞团（图2-C、D、E、F）,这些胚性愈伤组织细胞以平周、垂周或任意方向迅速分裂，扩大胚性愈伤组织区域（图2-C、D、E、F、G、H、I）。

但观察表明，胚性愈伤组织的这种形成方式并不是主要的。

图2棉花下胚轴诱导愈伤过程中部分非胚性愈伤组织细胞分化为胚性愈伤组织

Fig.2Differentiationofembryogeniccallifromnon-embryoniccellsduringinductionofcallifromhypocotylexplantsofcotton.

A-B：

非胚性细胞分化形成的胚性细胞；

C-I：

胚性细胞不同方向分裂形成的胚性愈伤组织。

A-B:

Embryogeniccellsdifferentiatedfromnon-embryoniccells;

C-I:

Embryogeniccallifromembryoniccellsdividingatdifferentplanes.

陆地棉品种Coker201的下胚轴表皮具有一个个的紫黑色点（图3-A1），这些点是腺体所在位置。

石蜡切片观察表明，腺体周围的细胞也能直接分化形成胚性细胞（图A2、A3），进而扩增形成少量的肉眼可辨的胚性愈伤组织（图3-A4）。

组织学观察还表明，胚性愈伤组织也有外发生方式（图3-B1、B2、B3、B4）。

观察发现，在愈伤组织表面存在零星的胚性愈伤细胞团（图3-B2、B3），这些细胞团外围由一些死亡的细胞所覆盖（图3-B4），说明这些细胞团可能是由位于愈伤组织边缘的部分胚性细胞（图3-B1）通过活跃的有丝分裂活动和增殖而独立形成的，但并不排除由位于愈伤组织边缘的部分长形或长椭圆形的非胚性细胞转化而成的可能性。

图3棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的腺体处发生和外发生

Fig.3Originationofembryogeniccalliinthesurroundingofglandandfromoutercellsofcalliduringinductionofcallifromhypocotylexplantsofcotton.

A1：

下胚轴外植体；

A2-A4：

胚性愈伤组织在腺体处发生；

B1：

愈伤组织表面的胚性细胞；

B2-B4：

愈伤组织表面形成胚性组织。

A1:

Hypocotylexplants;

A2-A4:

Originationofembryoniccalliinthesurroundingofgland;

B1:

Embryoniccellsinexteriorofcalli;

B2-B4:

Originationofembryoniccallifromoutercellsofcalli.

2.2体细胞胚发生过程及其组织细胞学观察

2.2.1体细胞胚发生和发育的过程

与其它双子叶植物一样，棉花体细胞胚发育过程与合子胚发育过程类似，都有球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚这4个明显的阶段（图4）。

胚性愈伤细胞团（图5A）在转移到固体分化培养基上后，进一步分裂生长（图5-B1、B2、C1、C2、C3）。

到第3周，可以观察到大量的球形胚（图5-D1、D2、D3）；

第4周后能看到大量的球形胚分化为心形胚（图5-E1、E2、E3），并很快发育为鱼雷形胚（图5-E1、E2、E3），然后经过5-10d的培养，进一步发育为子叶胚（图5-F1、F2、F3）。

图4棉花单个胚性细胞团培养中不同发育阶段的体细胞胚

Fig.4Somaticembryosatdifferentdevelopmentalstagesintheculturesofindividualcottonembryogeniccellclusters.

A1-A6：

球形胚；

B1-B6：

心形胚；

C1-C6：

鱼雷形胚；

D1-D6：

子叶胚。

A1-A6:

Globularembryo;

B1-B6:

Heart-shapedembryo;

C1-C6:

Torpedo-shapedembryo;

D1-D6:

Cotyledonaryembryo.

2.2.2体细胞胚发生过程中的组织细胞学观察

大量的石蜡切片观察表明，棉花体细胞胚多数在胚性愈伤组织的表面或近表面发生（图6），少数在愈伤组织的内部发生（图7）。

位于胚性愈伤组织表面或近表面的将要发育成体细胞胚的胚性细胞经多次有丝分裂，依次形成2细胞原胚、3或4细胞原胚、多细胞原胚（图6-A、B）,并进一步发育成一个球形原胚（图6-C、D、E、F、G）。

部分发育成的球形原胚能够观察到具有明显的类胚柄组织与胚性愈伤组织相连（图6-C、E）。

球形原胚继续发育，类胚柄组织消失，位于球形原胚最表层的一圈细胞，细胞壁再次加厚，细胞排列整齐，细胞核明显，将整个球形胚紧紧包围起来，称为原表皮层，起保护和封闭胚体的作用，形成轮廓清晰的球形胚，与周围的组织分隔开来，部分球形胚从胚性愈伤组织的表面脱落下来（图6-H、I）。

图5棉花单个胚性细胞团培养中体细胞胚的发生和发育

Fig.5Somaticembryogenesisandembryodevelopmentintheculturesofindividualcottonembryogeniccellclusters.

培养当天；

培养7d；

培养14d；

D1-D3：

培养21d后出现球形胚；

E1-E3：

心形胚阶段；

鱼雷形胚阶段；

G1-G3：

子叶胚阶段。

Individualembryogeniccellclustersonthedayofinitialculture;

Cultureonthe7thday;

Cultureonthe14thday;

D1-D3:

Globularembryosformedafterculturefor21d;

E1-E3:

Heart-shapedstage;

Torpedo-shapedstage;

G1-G3:

Cotyledonarystage.

此外,胚性愈伤组织的内部也有一些分生组织的原胚细胞团（图7-C、D、E、F、G）,这些原胚体可能也是胚性细胞经分裂、分化，依次形成2细胞原胚、3或4细胞原胚、多细胞原胚（图7-A、B、C）,并进一步发育而成的。

这说明除了愈伤组织外层细胞可形成体细胞胚外,内层细胞也可形成体细胞胚,即存在内部发生和外部发生两种方式。

但值得一提的是，发生于胚性愈伤组织内部的体细胞胚胎容易中途停止发育，形成畸形胚。

图6棉花体细胞胚的单细胞起源和表面发生

Fig.6Somaticembryogenesisfromindividualcellsofsurfacelayerofembryogeniccalliincotton.

单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚（箭头所指）；

B：

具胚柄的多细胞原胚（箭头所指）；

C：

具胚柄的体胚；