实验操作Word下载.docx

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3）以ddH2O封闭，室温放置1h以上；

（可以加大促凝剂和催化剂的量，这样可以在短时间内完成分离胶配制；

4）当水和分离胶有了可见的明显界限，倒掉上层水，以滤纸吸尽多余的水分（或将制胶器倾斜用加样枪吸去水即可）；

手法轻柔一些，不可损伤分离胶；

3.配制积层胶：

1）浓度均为5％，只需选择体积，宁多勿少；

2）配制方法同上，灌至平低玻片上缘，插上加样梳，小心不能产生气泡；

3）室温放置1h以上；

（可以加大促凝剂和催化剂的量，节省时间）

1、BioRad的两块板需要分离胶7ml，积层胶3ml；

2、此时Tris－Cl为1.0M（pH6.8）；

3、加样梳不能做平行移动，只能上下移动；

4.样品处理：

1）细菌和细胞离心所得沉淀以PBS（也可以直接加入上样buffer）重悬，体积根据细菌量和细胞数调节；

2）以等倍体积2×

蛋白上样缓冲液混匀；

3）沸水煮3－5分钟；

时间不宜过长，尤其是Marker；

（Marker参看说明书要求，MBI的比较好，Promega的较差）

4）离心，取上清加样；

5.电泳：

1）电泳装置组装完毕后，加入甘氨酸电泳缓冲液，拔出加样梳；

2）依次加样；

（Marker最好选用预染型，这样在电泳时就可方便的判断目的蛋白的位置）；

3）积层胶电压宜小，90－120V，分离胶可增至120－180V。

甘氨酸电泳缓冲液，通常配制5×

贮存液，组成为：

94g甘氨酸，15.1gTris碱，5g电泳级SDS，定容至1000ml，电泳时稀释成1×

工作液；

二、转膜

1.待溴酚兰迁移至玻片底缘时停止电泳；

2.切胶；

1）轻柔启开双层玻片，使胶附着于一面玻片，此时还必须保留积层胶，因积层胶提示了泳道位置；

（也可以用梳子来寻找泳道）

应该非常小心，胶的韧度虽然较大，但一点小的损坏会导致越来越大的麻烦；

2）据泳道和预染Marker位置，以及目的蛋白的分子量确定胶的大小，尽量切去多余的胶，

通常包含目的蛋白上下各1－1.5cm；

3）将切好的胶放入电转缓冲液中浸泡（有报道浸泡15min－30min很好）。

注意做好标记以确定上下左右顺序；

（时间为几min即可，标记可以在胶上截一个角）

尤其当胶近似正方形时，标记尤为重要；

3.准备滤纸和NC膜；

1）按照胶的大小剪滤纸和NC膜，通常NC膜略小于胶，滤纸略小于NC膜，以避免短路（胶＞NC膜＞滤纸）；

NC膜和滤纸依照胶的位置做相同的标记，此时NC膜没有正反之

分；

因为三者的顺序为滤纸1——胶——NC膜——滤纸2，要避免滤纸1和NC膜、胶和滤纸2接触，一旦接触将导致短路，转膜失败；

2）滤纸共剪六层；

3）将NC膜和滤纸放入电转缓冲液中浸泡；

4.制备“三明治”；

1）用转移缓冲液浸泡海绵；

2）按照三层滤纸、胶、NC膜、三层滤纸的顺序依次将它们放在海绵上，注意不要相互移动；

理论上一旦胶与NC膜接触就开始发生蛋白的转移，因此尽可能不使两者之间有平行移动，这是所有杂交系统的通性；

3）装电转装置，注意正负极，胶在负极，NC膜在正极；

5.4℃电转过夜，电流约20mA；

25-30V。

也可以恒压100v一个小时（开始电流为200mA，终电流为400mA，或者200mA2个小时）。

1、检查电流大小，过高电流导致转移失败。

高电流通常是由于转移缓冲液配制不当引起的。

分子量大的蛋白质用低浓度的胶效果好些。

不同的膜可能有不同的转膜缓冲液，需要查询厂家的说明书。

2、电转缓冲液：

2.9g甘氨酸，5.8gTris碱，0.37gSDS，200ml甲醇，定容至1000ml；

三、杂交

（一）所需试剂：

1．封闭液：

PBST（1×

PBS＋5％脱脂奶粉＋0.05％Tween20）或者3%BSA的TBS

2．洗膜液：

即1×

PBS

3．考马斯亮兰染色液：

0.25g考马斯亮兰R250，以45ml甲醇，45mlddH2O，10ml冰乙酸的混合液充分溶解，滤纸过滤

4．脱色液：

45ml甲醇，45mlddH2O，10ml冰乙酸

（二）实验步骤：

1．封闭：

1）取出电转过夜的NC膜，朝向胶的方向为正面，做好标记；

2）将NC膜放入装有封闭液的小平皿中，置于摇床上缓速（小于70rpm）震荡1.5－2h，注意保证膜的所有部分与封闭液接触；

相对而言37℃摇床效果要好些，但室温也没有太大差别；

但是如果遇到有杂带的问题就要考虑用室温封闭了。

3）转膜后的胶以考马斯亮兰染色以检测转膜效果；

2．一抗结合；

（注意：

如果同一膜上要用不同的一抗则要将条带剪开分别加入）

1）以封闭液稀释一抗，稀释比例参照一抗说明书；

如果是自制血清就稀释500，1000甚至10000，100000

2）将NC膜转移至密封袋，加入一抗稀释液，排尽气泡，封好密封袋；

注意一定要将气泡排除，否则可能照成假阴性。

3）4℃过夜或者37℃摇床1.5－2h，但通常选择4℃过夜，效果好一些―――可以增加灵敏度；

1、4℃封闭过夜有可能会导致非特异结合增加，这有些矛盾；

2、尼龙膜应该在45到50摄氏度下10％BSA中封闭至少12h；

3、BSA是最常见的封闭剂，但BSA中常常污染有免疫球蛋白G，有时会影响结果；

3．二抗结合；

1）取出NC膜，放入含PBS（或者TBS）的平皿中洗涤，脱色摇床缓速震荡，共3次，每次10分钟；

2）以封闭液稀释二抗，稀释比例参照二抗说明书；

3）将NC膜转移至密封袋，加入二抗稀释液，排尽气泡，封好密封袋，室温放置或脱色摇床缓速震荡，1.5－2h或过夜。

四．显色

1．取出封闭袋中的NC膜，放入含PBS的平皿中洗涤，脱色摇床缓速震荡，共3次，每次10分钟；

2．在更小的平皿中先加ddH2O，具体体积参考NC膜大小，（通常10－15cm2的膜为4ml），依次加入DAB显色试剂盒中的A、C、B各数滴，（用多少mlddH2O就加多少滴相应液体），充分混匀，（注意DAB试剂有毒），将NC膜正面朝下，轻轻晃动平皿使液体与NC膜充分接触，直至显色，（通常3－5min，若过了10min还没反应，多半失败），看到条带显色估计达到最大强度后以ddH2O终止显色反应。

（30min以内）终止显色后尽快成像，最多可以放1周。

（避光保存）

3．成像存图。

（显色后膜的两侧显色强度不同的，做化学发光机器自动曝光要考虑把强的一面向镜头。

）

1．对于检测要求不高的样品，比如待检样品抗原达纳克级以上时，可采用DAB显色法进行WesternBlot及免疫组化检测。

如果样品浓度太低可以用化学发光法做。

若ELISA结果为阳性，则再以WesternBlot方法来再确认。

经由二阶段确认，可靠率达99%。

2．在Western,Southern或Northernblot实验系统中消除背景的“黄金”搭配（所有结合清洗步骤）：

0.025%（w/v）SDS0.05%（v/v）TritonX-100（在阻断液中0.1%）

3．Westernblot膜的选择：

NC膜的特点是价格低廉并且封闭的步骤简单快捷。

但是如果使用NC膜发现蛋白质结合率不够需要更高的结合率（尼龙膜480远远大于NC膜的80每平方厘米）（或者干脆某种蛋白和NC膜结合力不强－高分子量，酸性蛋白等）就可以选择尼龙膜。

当需要更高的机械强度时也可以使用尼龙膜。

但是尼龙膜比较贵些，封闭时间长步骤复杂且不能用阴离子染料染色。

―――取膜必须用镊子或者戴手套。

4．如果转移效率低怎么办？

转移缓冲液中加入终浓度为20％的甲醇。

它可以增加蛋白与NC膜的结合能力。

还可以预防凝胶变形；

大分子量蛋白转移时间要延长点；

转移缓冲液中加入终浓度为0.1％的SDS（但是SDS可能降低某些蛋白的转移效率）；

使用小孔径的NC膜，如0.2um的；

转移完成后立即用戊二醛交联，可以增加小分子酸性蛋白与同膜的稳定性，防止其扩散，用前用含0.2%的戊二醛的TBS中浸泡45min。

5．检测方法的选择：

DAB染色，即辣根过氧化物酶方法，探测10pg级

化学发光，免疫金，同位素检测1pg级

6．一抗通常保存于4摄氏度（详细看说明书），稀释后可以保存在－20摄氏度。

注意反复冻融会造成抗体聚集失活。

7．SDS－PAGE会导致抗原决定簇失活，如果怀疑是此原因，可以不做SDS－PAGE，而直接做Elisa或者直接将蛋白液体（甚至不要煮）点在NC膜上做。

这样没有SDS参与可以作为找到原因的途径――如果显色就说明簇失活的可能很大。

没有显色说明1抗、2抗等都可能出了问题。

但是有些表达系统或者表达条件注定一些簇就是失活的，这样用的单抗要是正巧撞上了那些簇就太不走运了。

显色液也需要鉴定，比如通过看背景是否有显色情况，或者加少量显色液到装过二抗的管中看看是否显色。

所以建议大家尽量用多抗，不行的话换个公司的抗体可能有奇效（精辟！

）。

WesternBlot（PVDF膜）

一、准备试剂：

1、TBST（Tris-BufferedSaline-Tween-20）:

10mMTris-HCl（pH8.0）

150mMNaCl

0.05%Tween-20（afterallandwateraremixed,addtween-20）

2、TransferBuffer:

800ml甲醇（终浓度为20％）

12.12gTrisBase

57.63g甘氨酸

加入ddH2O使总量达到4L

最终pH值应该是8.3~8.6,但不能通过加酸或者碱来调节。

二、实验步骤（一些具体步骤可以参考NC膜的方法）：

1、首先，将蛋白质样品在SDS-PAGE胶中进行电泳（180V，30mA）。

2、将转移膜（PVDF）在甲醇中浸泡1分钟后，去离子水中洗涤3次，浸泡于转移缓冲液中待用。

3、组装转移组合，顺序如下：

负极起：

塑料底垫——底层泡沫——滤纸——SDS-PAGE胶——PVDF膜——滤纸——上层泡沫——塑料底垫

应该绝对避免层与层之间有气泡的现象。

4、将转移组合放入转移电泳槽中进行蛋白质转移（4°

C最佳）。

转移条件

为：

250mA，60-100minutes。

5、转移完成后，将PVDF膜取出，采用封闭液（5-10%milk-TSBT）在摇床上

封闭2小时或过夜。

6、准备一抗：

按一般推荐比例1:

500-1:

1000将一抗稀释在封闭液中。

7、将PVDF膜直接放入一抗-封闭液混合液体中，液体能够覆盖膜表面即

可，室温下在摇床上震荡1-2小时。

绝对避免让膜变干的现象

8、使用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。

9、准备二抗：

5,000-10,000将二抗稀释于TBST缓冲液中（二抗直接联结于辣根过氧化酶HRP）。

10、将PVDF膜放入二抗-TBST混合液中，室温下在摇床上震荡1小时。

11、使用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。

12、显色：

按照显色底物说明配制HRP反应底物，将PVDF膜放入显色底物中，反应1分钟后取出。

13、将PVDF透明薄膜包装后防入X成像系统中曝光，或直接于成像系统中成像。

如使用二抗联结生物素-亲和素-辣根过氧化酶系统，则在第11步后，加入亲和素-辣根过氧化酶（于TBST中按1：

5000-10000稀释）混合液，室温下摇床震荡30分钟，然后TBST洗涤3次，每次5分钟。

再最后进入步骤12。

Southernblot

一、试剂准备：

1、变性液（1.5MNaCl/0.5MNaOH）

87.75gNaCl

20gNaOH

加水至1升。

2、中和液（1MTris,PH7.4/1.5MNaCl）

121gTris

加水800ml，调PH至7.4，再加水至1升。

3、20×

SSC

175.3gNaCl

88.2g柠檬酸钠（即柠檬酸三钠）

加水800ml，用NaOH调PH到7.0，再加水至1升，高压蒸气灭菌。

4、6×

灭菌后的20×

SSC60ml加灭菌水140ml即可。

5、50×

Denhardt试剂

Filcoll4005g

PVP5g

BSA5g

加DEPC处理过的水500ml（不能高压灭菌，以防沉淀产生）。

6、10mg/ml鲑鱼精DNA

10mg鲑鱼精DNA，溶于1ml双蒸水中，用1ml针头快速抽吸以剪断DNA，1000C10分钟，分装后贮存于-200C。

7、预杂交液（6×

SSC/5×

Denhardt试剂/0.5%SDS/500ug/ml鲑鱼精DNA/50%甲

酰胺）

20×

SSC30ml

50×

Denhardt试剂10ml

10%SDS5ml

10mg/ml鲑鱼精DNA5ml

甲酰胺50ml

8、2×

SSC/0.5%SDS

NaCl17.53g

柠檬酸钠8.82g

10%SDS1ml

DEPC液1ml

加水800ml，用NaOH调PH至7.0，再加水至1000ml，370C12小时后，高压灭菌消毒。

9、2×

SSC/0.1%SDS

10、0.1×

NaCl0.8765g

柠檬酸钠0.441g

11、0.1×

加水800ml，用NaOH调PH至7.0，再加水至1000ml，370C12小时后，高压灭菌。

1、将待检样本DNA与核酸上样缓冲液混匀后，上样于1%琼脂糖凝胶孔中（含

EB）电泳，电压5-10伏/厘米。

2、估计待检样本电泳至凝胶中间部分时，终止电泳，于凝胶成像仪的紫外光下

观察电泳情况，并留存凝胶电泳图。

紫光照射时间不宜过长。

3、用锋利刀片切去凝胶无用部分，并切去一角用作标记凝胶的反正面，用直尺

精确测量凝胶的长和宽。

4、将凝胶置于变性液（1.5MNaCl/0.5MNaOH）中振摇1小时。

5、凝胶用双蒸水简短漂洗后，置于中和液（1MTris,PH7.4/1.5MNaCl），振摇

30分钟，再换中和液振摇15分钟。

（此期间准备下6-8步）。

6、准备好转移装置，内盛20×

SSC溶液，中间平台上置一长条形滤纸，使滤纸

的两端浸泡于溶液中。

将滤纸用20×

SSC溶液完全湿润，并使之与平台间无气泡。

7、裁出一张硝酸纤维滤膜（NC膜），其长宽分别大于凝胶长宽约1mm，剪去

NC膜的一角使其与凝胶一致，并作为标记。

8、将NC膜漂浮于双蒸水中，直至其完全被湿透，然后转入20×

SSC中浸泡至

少5分钟。

9、将用中和液浸泡过的凝胶取出，将其翻转使其背面向上，置于转移装置平台

的滤纸上，使凝胶与滤纸之间无气泡。

凝胶周围置条形塑料薄膜，以防止转膜时吸水纸直接与液体接触发生短路现象。

10、凝胶上先放置NC膜，再放两张同样大小且被20×

SSC浸泡过的滤纸，其上再放置数层吸水纸巾，然后放一玻璃板，最后放置重约500g的重物。

11、转移过夜（约12-16小时），其间换吸水纸巾一至两次。

12、转移完毕后，轻轻移去重物及吸水纸，用纸笔在滤膜上标记加样孔位置及正反面。

13、剥离凝胶，用6×

SSC浸泡滤膜5分钟。

14、室温下晾干滤膜30分钟以上。

15、将晾干的滤膜放在两张滤纸中间，外用两块玻璃板固定，于800C干烤1.5小时。

16、将烤干的滤膜漂浮于6×

SSC上，待其完全浸润后，再将其浸泡2分钟。

17、将湿润的滤膜用塑料袋封闭，滤膜的正面朝上，以每平方厘米滤膜加入0.2ml

的量加入预杂交液。

420C水浴2小时。

18、直接向预杂交液中加入标记好的探针（探针标记参照说明书执行），封闭后，杂交过夜，420C，12-16小时。

19、杂交完后，取出滤膜，进行漂洗。

（1）用大量2×

SSC/0.5%SDS浸泡5分钟，室温下。

（2）用2×

SSC/0.1%SDS浸泡15分钟，室温下。

（3）用0.1×

SSC/0.5%SDS浸泡1小时，370C，温和摇动。

（4）用0.1×

SSC/0.5%SDS浸泡1小时，680C。

（5）用0.1×

SSC短暂漂洗一下，晾干，但不宜过分干燥，以防影响二次

杂交。

（6）其间可用探测器观察滤膜上放射强度的变化，随时优化操作条件。

20、用塑料薄膜将滤膜封闭，将滤膜正面朝上固定于暗盒中，于暗室内将X胶片放于暗盒内，-700C曝光16-24小时后，将胶片在暗室内冲洗以观察结果。

Northernblot

一、试剂的准备：

1、甲醛

2、甲酰胺

3、5×

甲醛凝胶电泳缓冲液

MOPS20.6g

50mM乙酸钠800ml

用2MNaOH调PH值到7.0，加10ml0.5MEDTA（PH=8.0），加DEPC处理过的水到1升，再用0.22um滤膜过滤，避光保存于室温。

4、RNA上样缓冲液（50%甘油/1mMEDTA/0.25%溴酚蓝/0.25%二甲苯青FF）

甘油25ml

0.5MEDTA0.1ml

溴酚蓝0.125g

二甲苯青FF0.125g

DEPC液50ul

加水定容至50ml，高压灭菌后分装待用。

5、其他：

变性液（0.05MNaOH）

6×

预杂交液

1×

0.2×

（与Southernblot的步骤相似，关键是所用的器皿必需去除RNA酶，胶的制备、上样缓冲液及电泳缓冲液不相同。

1、变性琼脂糖凝胶的制备：

适量琼脂糖溶于DEPC处理的双蒸水中，加热使其完全溶解后，冷却至600C，加入5×

甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛（1：

35：

1.1），混匀后灌制凝胶。

2、RNA样品上样前预处理：

按顺序将下列样品加于EP管中混匀，可按照比例

增加总量

RNA4.5ul

5×

甲醛缓冲液2ul

甲醛3.5ul

甲酰胺10ul

650C15分钟后，置于冰上冷却，然后离心，待用。

3、将变性凝胶置于1×

甲醛凝胶电泳缓冲液中，加样前预电泳5分钟。

4、将上述预处理过的待检RNA与2ul灭菌过的RNA上样缓冲液混匀，上样于1-1.5%变性琼脂糖凝胶孔中（不含EB）电泳，电压3-4伏/厘米或更低。

5、估计待检样本电泳至凝胶中间部分时，终止电泳。

一般可不进行EB染色，

以防过多EB结合后影响下一步转膜效果。

但也可以短时间（少于5分钟）

染色后观察作为参照。

6、用锋利刀片切去凝胶无用部分，并切去一角以标记凝胶的反正面，用直尺精

确测量凝胶的长和宽。

7、如待转移的RNA样品大于2.5kb,将凝胶置于变性液（0.05MNaOH）中浸泡

20分钟，使其断裂以利于转膜，但时间不易过久，以防其变得过短，而不能牢固结合于NC膜上。

8、凝胶用DEPC处理过的双蒸水淋洗后，凝胶置于20×

SSC浸泡20分钟。

9、准备好转移装置，内盛DEPC处理过的20×

SSC溶液，中间平台上置一长

条形滤纸，使滤纸的两端浸泡于溶液中。

10、裁出一张硝酸纤维滤膜（NC膜），其长宽分别大于凝胶长宽约1mm，剪去NC膜的一角使其与凝胶一致，并作为标记。

11、将NC膜漂浮于双蒸水中，直至其完全被湿透，然后转入20×

SSC中浸泡至少5分钟。

12、将用中和液浸泡过的凝胶取出，将其翻转使其背面向上，置于转移装置平台的滤纸上，使凝胶与滤纸之间无气泡。

13、凝胶上先放置NC膜，再放两张同样大小且被20×

SSC浸泡过的滤纸，其

上再放置数层吸水纸巾，然后放一玻璃板，最后放置重约500g的重物。

14、转移过夜（约12-16小时），其间换吸水纸巾一至两次。

15、转移完毕后，轻轻移去重物及吸水纸，用纸笔在滤膜上标记加样孔位置，并记住凝胶的正反面。

16、剥离凝胶，用6×

17、室温下晾干滤膜30分钟以上。

18、将晾干的滤膜放在两张滤纸中间，外用两块玻璃板固定，于800C干烤1.5小时。

19、将烤干的滤膜漂浮于6×

20、将湿润的滤膜用塑料袋封闭，滤膜的正面朝上，以每平方