实验操作Word下载.docx

1、3）以ddH2O封闭，室温放置1h以上；（可以加大促凝剂和催化剂的量，这样可以在短时间内完成分离胶配制；4）当水和分离胶有了可见的明显界限，倒掉上层水，以滤纸吸尽多余的水分（或将制胶器倾斜用加样枪吸去水即可）；手法轻柔一些，不可损伤分离胶；3. 配制积层胶：1）浓度均为5，只需选择体积，宁多勿少；2）配制方法同上，灌至平低玻片上缘，插上加样梳，小心不能产生气泡；3）室温放置1h以上；（可以加大促凝剂和催化剂的量，节省时间）1、BioRad的两块板需要分离胶7ml，积层胶3ml；2、此时TrisCl为1.0M（pH6.8）；3、加样梳不能做平行移动，只能上下移动；4. 样品处理：1）细菌和细胞离

2、心所得沉淀以PBS（也可以直接加入上样buffer）重悬，体积根据细菌量和细胞数调节；2）以等倍体积2蛋白上样缓冲液混匀；3）沸水煮35分钟；时间不宜过长，尤其是Marker；（Marker参看说明书要求，MBI的比较好，Promega的较差）4）离心，取上清加样；5. 电泳：1）电泳装置组装完毕后，加入甘氨酸电泳缓冲液，拔出加样梳；2）依次加样；（Marker最好选用预染型，这样在电泳时就可方便的判断目的蛋白的位置）；3）积层胶电压宜小，90120V，分离胶可增至120180V。甘氨酸电泳缓冲液，通常配制5贮存液，组成为：94g甘氨酸，15.1gTris碱，5g电泳级SDS，定容至1000m

3、l，电泳时稀释成1工作液；二、转膜1. 待溴酚兰迁移至玻片底缘时停止电泳；2. 切胶；1） 轻柔启开双层玻片，使胶附着于一面玻片，此时还必须保留积层胶，因积层胶提示了泳道位置；（也可以用梳子来寻找泳道）应该非常小心，胶的韧度虽然较大，但一点小的损坏会导致越来越大的麻烦；2） 据泳道和预染Marker位置，以及目的蛋白的分子量确定胶的大小，尽量切去多余的胶，通常包含目的蛋白上下各11.5cm；3） 将切好的胶放入电转缓冲液中浸泡（有报道浸泡15min30min很好）。注意做好标记以确定上下左右顺序；（时间为几min即可，标记可以在胶上截一个角）尤其当胶近似正方形时，标记尤为重要；3. 准备滤纸和

4、NC膜；1） 按照胶的大小剪滤纸和NC膜，通常NC膜略小于胶，滤纸略小于NC膜，以避免短路（胶NC膜滤纸）；NC膜和滤纸依照胶的位置做相同的标记，此时NC膜没有正反之分；因为三者的顺序为滤纸1胶NC膜滤纸2，要避免滤纸1和NC膜、胶和滤纸2接触，一旦接触将导致短路，转膜失败；2） 滤纸共剪六层；3） 将NC膜和滤纸放入电转缓冲液中浸泡；4. 制备“三明治”；1） 用转移缓冲液浸泡海绵；2） 按照三层滤纸、胶、NC膜、三层滤纸的顺序依次将它们放在海绵上，注意不要相互移动；理论上一旦胶与NC膜接触就开始发生蛋白的转移，因此尽可能不使两者之间有平行移动，这是所有杂交系统的通性；3） 装电转装置，注意

5、正负极，胶在负极，NC膜在正极；5. 4电转过夜，电流约20mA；25-30V。也可以恒压100v一个小时（开始电流为200mA，终电流为400mA，或者200mA 2个小时）。1、检查电流大小，过高电流导致转移失败。高电流通常是由于转移缓冲液配制不当引起的。分子量大的蛋白质用低浓度的胶效果好些。不同的膜可能有不同的转膜缓冲液，需要查询厂家的说明书。2、电转缓冲液：2.9g甘氨酸，5.8gTris碱，0.37gSDS，200ml甲醇，定容至1000ml；三、杂交（一）所需试剂：1 封闭液：PBST（1PBS5脱脂奶粉0.05Tween20） 或者3%BSA 的TBS2 洗膜液：即1PBS3 考

6、马斯亮兰染色液：0.25g考马斯亮兰R250，以45ml甲醇，45mlddH2O，10ml冰乙酸的混合液充分溶解，滤纸过滤4 脱色液：45ml甲醇，45mlddH2O，10ml冰乙酸（二）实验步骤：1 封闭：1） 取出电转过夜的NC膜，朝向胶的方向为正面，做好标记；2） 将NC膜放入装有封闭液的小平皿中，置于摇床上缓速（小于70rpm）震荡1.52h，注意保证膜的所有部分与封闭液接触；相对而言37摇床效果要好些，但室温也没有太大差别；但是如果遇到有杂带的问题就要考虑用室温封闭了。3） 转膜后的胶以考马斯亮兰染色以检测转膜效果；2 一抗结合；（注意：如果同一膜上要用不同的一抗则要将条带剪开分别加

7、入）1） 以封闭液稀释一抗，稀释比例参照一抗说明书；如果是自制血清就稀释500，1000甚至10000，1000002） 将NC膜转移至密封袋，加入一抗稀释液，排尽气泡，封好密封袋；注意一定要将气泡排除，否则可能照成假阴性。3） 4过夜或者37摇床1.52h，但通常选择4过夜，效果好一些可以增加灵敏度；1、4封闭过夜有可能会导致非特异结合增加，这有些矛盾；2、尼龙膜应该在45到50摄氏度下10BSA中封闭至少12h；3、BSA是最常见的封闭剂，但BSA中常常污染有免疫球蛋白G，有时会影响结果；3 二抗结合；1） 取出NC膜，放入含PBS（或者TBS）的平皿中洗涤，脱色摇床缓速震荡，共3次，每次

8、10分钟；2） 以封闭液稀释二抗，稀释比例参照二抗说明书；3） 将NC膜转移至密封袋，加入二抗稀释液，排尽气泡，封好密封袋，室温放置或脱色摇床缓速震荡，1.52h或过夜。四显色1 取出封闭袋中的NC膜，放入含PBS的平皿中洗涤，脱色摇床缓速震荡，共3次，每次10分钟；2 在更小的平皿中先加ddH2O，具体体积参考NC膜大小，（通常1015cm2的膜为4ml），依次加入DAB显色试剂盒中的A、C、B各数滴，（用多少mlddH2O就加多少滴相应液体），充分混匀，（注意DAB试剂有毒），将NC膜正面朝下，轻轻晃动平皿使液体与NC膜充分接触，直至显色，（通常35min，若过了10min还没反应，多半失

9、败），看到条带显色估计达到最大强度后以ddH2O终止显色反应。（30min以内）终止显色后尽快成像，最多可以放1周。（避光保存）3 成像存图。（ 显色后膜的两侧显色强度不同的，做化学发光机器自动曝光要考虑把强的一面向镜头。）1 对于检测要求不高的样品，比如待检样品抗原达纳克级以上时，可采用DAB显色法进行Western Blot及免疫组化检测。如果样品浓度太低可以用化学发光法做。若ELISA结果为阳性，则再以Western Blot方法来再确认。经由二阶段确认，可靠率达99%。2 在Western,Southern 或 Northern blot 实验系统中消除背景的“黄金”搭配 （ 所有结合

10、清洗步骤）： 0.025%（w/v） SDS 0.05% （v/v） Triton X-100 （在阻断液中0.1%）3 Western blot 膜的选择：NC膜的特点是价格低廉并且封闭的步骤简单快捷。但是如果使用NC膜发现蛋白质结合率不够需要更高的结合率（尼龙膜480远远大于NC膜的80每平方厘米）（或者干脆某种蛋白和NC膜结合力不强高分子量，酸性蛋白等）就可以选择尼龙膜。当需要更高的机械强度时也可以使用尼龙膜。但是尼龙膜比较贵些，封闭时间长步骤复杂且不能用阴离子染料染色。取膜必须用镊子或者戴手套。4 如果转移效率低怎么办？转移缓冲液中加入终浓度为20的甲醇。它可以增加蛋白与NC膜的结合能

11、力。还可以预防凝胶变形；大分子量蛋白转移时间要延长点；转移缓冲液中加入终浓度为0.1的SDS（但是SDS可能降低某些蛋白的转移效率）；使用小孔径的NC膜，如0.2um的；转移完成后立即用戊二醛交联，可以增加小分子酸性蛋白与同膜的稳定性，防止其扩散，用前用含0.2%的戊二醛的TBS中浸泡45min。5 检测方法的选择：DAB染色，即辣根过氧化物酶方法 ，探测10pg级化学发光，免疫金，同位素检测1pg级6 一抗通常保存于4摄氏度（详细看说明书），稀释后可以保存在20摄氏度。注意反复冻融会造成抗体聚集失活。7 SDSPAGE会导致抗原决定簇失活， 如果怀疑是此原因，可以不做SDSPAGE，而直接做

12、Elisa或者直接将蛋白液体（甚至不要煮）点在NC膜上做。这样没有SDS参与可以作为找到原因的途径如果显色就说明簇失活的可能很大。没有显色说明1抗、2抗等都可能出了问题。但是有些表达系统或者表达条件注定一些簇就是失活的，这样用的单抗要是正巧撞上了那些簇就太不走运了。显色液也需要鉴定，比如通过看背景是否有显色情况，或者加少量显色液到装过二抗的管中看看是否显色。所以建议大家尽量用多抗，不行的话换个公司的抗体可能有奇效（精辟！）。Western Blot（PVDF膜）一、 准备试剂：1、 TBST （Tris-Buffered Saline-Tween-20）:10mM Tris-HCl （pH8.

13、0）150mM NaCl0.05% Tween-20 （after all and water are mixed, add tween-20）2、 Transfer Buffer:800ml 甲醇（终浓度为20）12.12g Tris Base57.63g 甘氨酸 加入ddH2O 使总量达到4L 最终pH 值应该是 8.38.6, 但不能通过加酸或者碱来调节。二、实验步骤（一些具体步骤可以参考NC膜的方法）：1、 首先，将蛋白质样品在SDS-PAGE胶中进行电泳（180V，30mA）。2、 将转移膜（PVDF）在甲醇中浸泡1分钟后，去离子水中洗涤3次，浸泡于转移缓冲液中待用。3、 组装转移组

14、合，顺序如下：负极起：塑料底垫底层泡沫滤纸SDS-PAGE胶PVDF膜滤纸上层泡沫塑料底垫应该绝对避免层与层之间有气泡的现象。4、 将转移组合放入转移电泳槽中进行蛋白质转移（4C最佳）。转移条件为： 250mA ，60-100 minutes 。5、 转移完成后，将PVDF膜取出，采用封闭液 （5-10% milk-TSBT） 在摇床上封闭2小时或过夜。6、 准备一抗：按一般推荐比例1:500-1:1000将一抗稀释在封闭液中。7、 将PVDF膜直接放入一抗-封闭液混合液体中，液体能够覆盖膜表面即可 ，室温下在摇床上震荡1-2小时。绝对避免让膜变干的现象8、 使用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3

15、次，每次5分钟。9、 准备二抗：5,000-10,000将二抗稀释于TBST缓冲液中（二抗直接联结于辣根过氧化酶HRP）。10、将PVDF膜放入二抗-TBST混合液中，室温下在摇床上震荡1小时。11、使用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。12、显色：按照显色底物说明配制HRP反应底物，将PVDF膜放入显色底物中，反应1分钟后取出。13、将PVDF透明薄膜包装后防入X成像系统中曝光，或直接于成像系统中成像。如使用二抗联结生物素-亲和素-辣根过氧化酶系统，则在第11步后，加入 亲和素-辣根过氧化酶（于TBST中按1：5000-10000稀释）混合液，室温下摇床震荡30分钟，然后TBST

16、洗涤3次，每次5分钟。再最后进入步骤12。Southern blot 一、试剂准备：1、 变性液（1.5M NaCl/0.5M NaOH）87.75g NaCl20g NaOH加水至1升。2、 中和液（1M Tris,PH 7.4/1.5M NaCl）121g Tris加水800ml，调PH至7.4，再加水至1升。3、 20SSC175.3g NaCl88.2g 柠檬酸钠（即柠檬酸三钠）加水800ml，用NaOH调PH到7.0，再加水至1升，高压蒸气灭菌。4、 6灭菌后的20SSC 60ml加灭菌水140ml即可。5、 50Denhardt试剂Filcoll 400 5gPVP 5gBSA 5

17、g加DEPC处理过的水500ml（不能高压灭菌，以防沉淀产生）。6、 10mg/ml 鲑鱼精DNA 10mg鲑鱼精DNA，溶于1ml双蒸水中，用1ml针头快速抽吸以剪断DNA，1000C 10分钟，分装后贮存于-200C。7、 预杂交液（6SSC/5Denhardt试剂/0.5%SDS/500ug/ml 鲑鱼精DNA/50%甲酰胺）20SSC 30ml50Denhardt试剂 10ml10%SDS 5ml10mg/ml 鲑鱼精DNA 5ml甲酰胺 50ml8、 2SSC/0.5%SDSNaCl 17.53g柠檬酸钠 8.82g10%SDS 1mlDEPC液 1ml加水800ml，用NaOH调P

18、H至7.0，再加水至1000ml，370C 12小时后，高压灭菌消毒。9、 2SSC/0.1%SDS10、0.1NaCl 0.8765g柠檬酸钠 0.441g11、0.1加水800ml，用NaOH调PH至7.0，再加水至1000ml，370C 12小时后，高压灭菌。1、 将待检样本DNA与核酸上样缓冲液混匀后，上样于1%琼脂糖凝胶孔中（含EB）电泳，电压5-10伏/厘米。2、 估计待检样本电泳至凝胶中间部分时，终止电泳，于凝胶成像仪的紫外光下观察电泳情况，并留存凝胶电泳图。紫光照射时间不宜过长。3、 用锋利刀片切去凝胶无用部分，并切去一角用作标记凝胶的反正面，用直尺精确测量凝胶的长和宽。4、

19、将凝胶置于变性液（1.5M NaCl/0.5M NaOH）中振摇1小时。5、 凝胶用双蒸水简短漂洗后，置于中和液（1M Tris,PH 7.4/1.5M NaCl），振摇30分钟，再换中和液振摇15分钟。（此期间准备下6-8步）。6、 准备好转移装置，内盛20SSC溶液，中间平台上置一长条形滤纸，使滤纸的两端浸泡于溶液中。将滤纸用20SSC溶液完全湿润，并使之与平台间无气泡。7、 裁出一张硝酸纤维滤膜（NC膜），其长宽分别大于凝胶长宽约1mm，剪去NC膜的一角使其与凝胶一致，并作为标记。8、 将NC膜漂浮于双蒸水中，直至其完全被湿透，然后转入20SSC中浸泡至少5分钟。9、 将用中和液浸泡过的

20、凝胶取出，将其翻转使其背面向上，置于转移装置平台的滤纸上，使凝胶与滤纸之间无气泡。凝胶周围置条形塑料薄膜，以防止转膜时吸水纸直接与液体接触发生短路现象。10、凝胶上先放置NC膜，再放两张同样大小且被20SSC浸泡过的滤纸，其上再放置数层吸水纸巾，然后放一玻璃板，最后放置重约500g的重物。11、转移过夜（约12-16小时），其间换吸水纸巾一至两次。12、转移完毕后，轻轻移去重物及吸水纸，用纸笔在滤膜上标记加样孔位置及正反面。13、剥离凝胶，用6SSC浸泡滤膜5分钟。14、室温下晾干滤膜30分钟以上。15、将晾干的滤膜放在两张滤纸中间，外用两块玻璃板固定，于800C干烤1.5小时。16、将烤干的

21、滤膜漂浮于6SSC上，待其完全浸润后，再将其浸泡2分钟。17、 将湿润的滤膜用塑料袋封闭，滤膜的正面朝上，以每平方厘米滤膜加入0.2ml的量加入预杂交液。420C水浴2小时。18、直接向预杂交液中加入标记好的探针（探针标记参照说明书执行），封闭后，杂交过夜，420C，12-16小时。19、 杂交完后，取出滤膜，进行漂洗。（1） 用大量2SSC/0.5%SDS浸泡5分钟，室温下。（2） 用2SSC/0.1%SDS浸泡15分钟，室温下。（3） 用0.1SSC/0.5%SDS浸泡1小时，370C，温和摇动。（4） 用0.1SSC/0.5%SDS浸泡1小时，680C。（5） 用0.1SSC短暂漂洗一下

22、，晾干，但不宜过分干燥，以防影响二次杂交。（6） 其间可用探测器观察滤膜上放射强度的变化，随时优化操作条件。20、 用塑料薄膜将滤膜封闭，将滤膜正面朝上固定于暗盒中，于暗室内将X胶片放于暗盒内，-700C曝光16-24小时后，将胶片在暗室内冲洗以观察结果。Northern blot一、试剂的准备：1、 甲醛2、 甲酰胺3、 5甲醛凝胶电泳缓冲液MOPS 20.6g50mM乙酸钠 800ml用2M NaOH调PH值到7.0，加10ml 0.5M EDTA（PH=8.0），加DEPC处理过的水到1升，再用0.22um滤膜过滤，避光保存于室温。4、 RNA上样缓冲液（50%甘油/1mM EDTA/0

23、.25%溴酚蓝/0.25%二甲苯青FF）甘油 25ml0.5MEDTA 0.1ml溴酚蓝 0.125g二甲苯青FF 0.125gDEPC液 50ul加水定容至50ml，高压灭菌后分装待用。5、 其他：变性液（0.05M NaOH）6预杂交液10.2（与Southern blot的步骤相似，关键是所用的器皿必需去除RNA酶，胶的制备、上样缓冲液及电泳缓冲液不相同。1、 变性琼脂糖凝胶的制备：适量琼脂糖溶于DEPC处理的双蒸水中，加热使其完全溶解后，冷却至600C，加入5甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛（1：35：1.1），混匀后灌制凝胶。2、 RNA样品上样前预处理：按顺序将下列样品加于EP管中混匀，可

24、按照比例增加总量RNA 4.5ul5甲醛缓冲液 2ul甲醛 3.5ul甲酰胺 10ul650C 15分钟后，置于冰上冷却，然后离心，待用。3、 将变性凝胶置于1甲醛凝胶电泳缓冲液中，加样前预电泳5分钟。4、 将上述预处理过的待检RNA与2ul灭菌过的RNA上样缓冲液混匀，上样于1-1.5%变性琼脂糖凝胶孔中（不含EB）电泳，电压3-4伏/厘米或更低。5、 估计待检样本电泳至凝胶中间部分时，终止电泳。一般可不进行EB染色，以防过多EB结合后影响下一步转膜效果。但也可以短时间（少于5分钟）染色后观察作为参照。6、 用锋利刀片切去凝胶无用部分，并切去一角以标记凝胶的反正面，用直尺精确测量凝胶的长和宽

25、。7、 如待转移的RNA样品大于2.5kb,将凝胶置于变性液（0.05M NaOH）中浸泡20分钟，使其断裂以利于转膜，但时间不易过久，以防其变得过短，而不能牢固结合于NC膜上。8、 凝胶用DEPC处理过的双蒸水淋洗后，凝胶置于20SSC浸泡20分钟。9、 准备好转移装置，内盛DEPC处理过的20SSC溶液，中间平台上置一长条形滤纸，使滤纸的两端浸泡于溶液中。10、裁出一张硝酸纤维滤膜（NC膜），其长宽分别大于凝胶长宽约1mm，剪去NC膜的一角使其与凝胶一致，并作为标记。11、将NC膜漂浮于双蒸水中，直至其完全被湿透，然后转入20SSC中浸泡至少5分钟。12、 将用中和液浸泡过的凝胶取出，将其翻转使其背面向上，置于转移装置平台的滤纸上，使凝胶与滤纸之间无气泡。13、 凝胶上先放置NC膜，再放两张同样大小且被20SSC浸泡过的滤纸，其上再放置数层吸水纸巾，然后放一玻璃板，最后放置重约500g的重物。14、 转移过夜（约12-16小时），其间换吸水纸巾一至两次。15、 转移完毕后，轻轻移去重物及吸水纸，用纸笔在滤膜上标记加样孔位置，并记住凝胶的正反面。16、 剥离凝胶，用617、 室温下晾干滤膜30分钟以上。18、 将晾干的滤膜放在两张滤纸中间，外用两块玻璃板固定，于800C干烤1.5小时。19、 将烤干的滤膜漂浮于620、 将湿润的滤膜用塑料袋封闭，滤膜的正面朝上，以每平方