培养基配制及适用性检查标准操作规程Word文件下载.docx

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2.微生物检验主管：

负责对日常配制培养基的规范操作进行监督。

内容

1培养基的申购

根据检验项目、工作量和工作进度的需求，提前一个月进行所需的培养基申购。

申购时需指定培养基供应商，必要时进行供应商审计。

2培养基的验收

培养基到货后，微生物室检验员应进行验收。

验收内容包括核对品名、数量、规格、生产厂商，应与申购单一致；

检查培养基包装有无破损、包装是否完整、产品是否在有效期内。

验收合格后，登记于《培养基领用台账》（附记录文件编号：

SMP-10-QC-009-02（00））。

3培养基的贮藏

未开封的脱水培养基贮存于阴凉室，使培养基处于低温、干燥、和避光条件下。

已开封的脱水培养基应盖紧，贮存于阴凉库。

灭菌好的培养基应进行预培养72h检查无菌后，置4～8℃冷藏保存待用。

灭菌后培养基储存期为7天。

4培养基的配制

培养基的配制和使用应填写《培养基配制及使用记录》（附记录文件编号：

培养基配制批号原则：

原材料批号-配制日期：

比如2011年1月1日配制的培养基，培养基干粉批号000000，配制批号为:

000000-110101。

配制好的培养基贴《培养基标签》（附记录文件编号：

R-SMP-10-QC-009-03）。

（注：

同一天同一培养基配置多次的，在原批号后加“-”加“数字”表示，如000000-110101-01）

培养基配制方法

使用商品化脱水合成培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如重量/体积、pH、灭菌条件和操作步骤等。

实验室使用各种基础成分制备培养基时，应按照配方准确配制，并记录相关信息如：

培养基名称和类型及试剂级别，每个成分物质含量、制造商、批号，pH值，培养基体积/分装体积，灭菌条件（灭菌方式、温度及时间），配制日期、人员等，以便溯源。

水、容器具要求：

培养基配制均采用纯化水，特殊说明时采用去离子水和蒸馏水。

培养基配制所用容器和配套器具应洁净。

对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器应先进行预灭菌，以保证培养基的无菌性。

称量与分装：

快速称量所需量的脱水合成培养基（必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末）。

以免吸潮。

先加入适量的水，充分混合。

注意避免培养基结块，然后加水至所需的量。

根据说明书要求选择是否加热。

分装体积不超过容器体积的2/3。

配制斜面等含琼脂的培养基也需加热煮沸至完全溶解后分装。

pH值的测定和调整

pH值采用pH计进行检测，温度25±

2℃。

取配后培养基10ml进行灭前pH测定。

另取20ml于50ml三角瓶与同批配制培养基同时灭菌冷却至25±

2℃检测灭后PH。

灭菌前后pH应按下表进行控制。

灭菌前可使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为L（约1mol/L）的盐酸溶液进行缓慢调整，避免反复调整而增加离子浓度。

灭菌后培养基不符合标准时视为不合格，不进行使用。

培养基灭菌

培养基和试剂应采用湿热灭菌法或过滤除菌法。

湿热灭菌在高压灭菌锅或蒸汽灭菌柜中进行，容器具若需湿热灭菌时，灭菌条件为121℃灭菌30min。

培养基严格按说明书条件进行灭菌。

培养基灭菌后应立即取出，不得存放于高压灭菌器中。

5培养基的质量控制

计数培养基适用性检查

菌种及菌液制备

菌种：

试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。

菌液制备：

按表1规定程序培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养18～24小时，取上述培养物1ml加入9ml％无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；

取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，25℃培养2～3天。

取上述培养物1ml加入9ml％无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；

取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，经25℃培养5～7天，加入3～5ml含%（ml/ml）聚山梨酯80的％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后吸出孢子悬液至无菌试管内，取上述培养物1ml加入9ml％无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；

若保存在2?

8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2?

8℃,在验证过的贮存期内使用。

阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

培养基适用性检査

微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

按表1规定，接种不大于l00cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1规定条件下培养。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在?

2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；

被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

表1试验菌液的制备和使用

试验菌株

试验菌液的制备

计数培养基适用性检查

计数方法适用性试验

需氧菌总数计数

霉菌和酵母菌总数计数

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养温度30?

35℃，培养时间18?

24小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30?

35℃,培养时间不超过3天，接种量不大100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30?

35℃,培养时间不超过3天，接种量不大于l00cfu

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）〔CMCC（B）10104〕

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30?

35℃，培养时间18?

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30?

35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于l00cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30?

35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于l00cfu

枯草芽孢杆菌{Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕

35℃，培养时间18-24小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu

35℃，培养时间不超过3天，接种量不大l00cfu

白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕

沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20?

25℃，培养时间2?

3天

胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30?

35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20?

25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30?

35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度?

黑曲霉

（Aspergillusniger）〔CMCC（F）98003〕

沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度20?

25℃，培养时间5?

7天，或直到获得丰富的孢子

35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu

胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30?

沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20?

控制菌检查用培养基适用性检查

菌种及菌液制备

试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养18～24小时，取上述培养物1ml加入9ml％无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；

取上述培养物1ml加入9ml％无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；

培养基适用性检查

控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。

控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。

各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。

表1控制菌检査用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性

控制菌检查

培养基

特性

耐胆盐革兰阴性菌

肠道菌增菌液体培养基

紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示特性

大肠埃希菌、铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

麦康凯液体培养基

麦康凯琼脂培养基

沙门菌

RV沙门菌增菌液体培养

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基

三糖铁琼脂培养基

指示能力

乙型副伤寒沙门菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖液体培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

念珠菌显色培养基

促生长能力+指示能力

液体培养基促生长能力检査分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生能力检査用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检査规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

培养基抑制能力检査接种不少于l00cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检査规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。

培养基指示特性检査用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

6培养基销毁

失效、检测用过培养基（无论是否有菌生长）均按废物进行高压蒸汽灭菌处理。

参照《实验室废弃物管理规程》（文件编号：

SMP-10-QC-014（00））。