Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究.docx

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Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究

Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究

马荣，陈曦海，唐丽萍，耿晓星，张云艳，张英蕾，王晶

【关键词】Survivin反义核酸；卵巢肿瘤；凋亡；多西他赛；多药耐药基因

　　ExperimentalstudyonapoptosisofovariancancercellsandreversaldocetaxeldrugresistanceinducedbySurvivinantisenseRNA

　　【Abstract】AIM:

ToestablishSurvivinantisenseRNAandexploreitseffectontheapoptosisofovariancancercellsandthesensitivitytodocetaxelanditsmechanismofreversingdocetaxeldrugresistance.METHODS:

Survivinantisenseeukaryoticvector（antipcDNA3svv）wastransferredintoSkov3cellsbyelectroporationandpositiveclonewasscreenedout.SurvivinproteinwasdetectedbyWesternblot;effectofapoptosisinducementwasobservedbyflowcytometry;sensitivitytodocetaxelwasexaminedbyMTT;expressionofMDR1mRNAwasdetected.RESULTS:

Survivinproteinofpositivelyclonedcellswerereducedobviouslyascomparedwiththatofnontransferedcells.Terminalapoptoticchangewasobservedbyflowcytometryandtheapoptosisratewas19%;IC50ofexperimentalgrouptodocetaxelwas（±）ng/mLandcontrolgroupwas±ng/mL,sothestatisticaldifferencewassignificant（P<.ExpressionofMDR1mRNAofSkov3SVVantigroupwasreducedobviouslyascomparedwiththatofSkov3group（P<.CONCLUSION:

SurvivinantisenseRNAcaninduceovariancancercellapoptosisandincreasethesensitivitytodocetaxelbyreducingtheexpressionofMDR1mRNA.

　　【Keywords】survivinantisenseRNA;ovarianneoplasms;apoptosis;docetaxel;MDR1

　　【摘要】目的:

构建Survivin反义真核表达载体（antipcDNA3svv），探讨其对卵巢癌的凋亡诱导作用、对多西他赛的化疗增敏作用及逆转耐药的机制.方式：

采纳Survivin反义核酸瞬时电转染法转染卵巢癌细胞系Skov3,挑选出阳性细胞株.以Westernblot检测Survivin蛋白的表达，用流式细胞仪检测其对Skov3的凋亡诱导作用，采纳MTT法检测其对多西他赛的化疗增敏作用，并检测实验组细胞（Skov3SVVanti）MDR1mRNA的表达.结果：

稳固表达antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其Survivin蛋白表达比未转染者明显降低，Skov3SVVanti组细胞流式细胞仪检测显示其凋亡率为19%，对多西他赛的IC50值为（±）ng/mL,而对照组（Skov3）为±ng/mL，不同具有明显的统计学意义（P<.Skov3SVVanti组MDR1mRNA表达较Skov3组明显减少（P<）.结论：

Survivin反义核酸可诱导卵巢癌细胞凋亡，并通过降低MDR1mRNA表达增强多西他赛化疗灵敏性.

　　【关键词】Survivin反义核酸；卵巢肿瘤；凋亡；多西他赛；多药耐药基因

　　0引言

　　上皮性卵巢癌是常见的妇科肿瘤，具有易转移及复发的特性，因此手术后化疗是卵巢癌标准化医治最重要的内容之一.多西他赛（docetaxel）又名泰索帝是医治卵巢癌的新药，其联合铂类医治卵巢癌临床减缓率远高于铂类联合其他化疗药.可是关于一些复发和多处转移的患者，多西他赛也产生了耐药现象.Survivin是新近发觉的IAP（inhibitorofapoptosisprotein）家族成员，能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用.已有研究证明［1］，Survivin基因的高表达与化疗耐药有紧密关系，抑制Survivin基因的表达能增加肿瘤组织对化疗的灵敏性，关于维持正常细胞生物学特性具有重要作用［2］.本研究旨在研究应用反义策略阻断Survivin表达，对诱导卵巢癌细胞凋亡及提高卵巢癌细胞多西他赛灵敏性的作用，并进一步探讨其逆转耐药的机制.

　　1材料和方式

　　细胞株和细胞培育人卵巢癌细胞株Skov3由哈尔滨医科大学肿瘤研究所惠赠.用含有100mL/L胎牛血清（Gibco公司）的RPMI1640（Gibco公司）培育（37℃，50mL/LCO2）.顺铂（&CoLtd公司）及多西他赛（AventisPharma,Dagenham公司）溶解于DMSO（Gibco公司），4℃保留.

　　反义真核表达载体（antipcDNA3svv）的构建Survivin基因通过RTPCR方式克隆取得.应用Trizol（Takara公司）法从卵巢癌细胞株Skov3中抽提总RNA，正向引物为5′atattctagaccatgggtgccccgacgttgc3′,反向引物5′aatcgaattctcaatccatggcagccagctg3′.PCR扩增条件为：

94℃预变性2min,94℃1min，60℃1min，72℃1min，共30循环,72℃延伸10min，扩增产物用琼脂糖回收试剂盒回收提纯后，扩增产物进行结尾连接腺嘌呤（A）反映，与带有胸腺嘧啶结尾（T）的载体（Invitrogen公司,CTGFPTOPO）连接.重组体转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选Amp阳性克隆者小量抽提质粒（质粒抽提试剂盒Takara公司），送去测序（上海生工公司）.经测序，选出其中反向连接者，命名为antipcDNA3svv.

　　电转染Skov3细胞及阳性克隆的挑选搜集6×106细胞于预冷的cm电转杯中，加入antipcDNA3svv15μL，终体积800μL，300V电压电穿孔ms，48h后传代培育，加入含有G418的培育基挑选阳性克隆，浓度由200mg/L渐加至800mg/L，共挑选42d，可见有抗性细胞生长，命名为Skov3SVVanti.上述一样条件空质粒转染Skov3,挑选出阳性克隆命名为Skov3neo.分为3组：

Skov3SVVanti组（实验组）、Skov3neo组（空质粒组）及Skov3组（空白对照组）.

　　转染细胞Survivin蛋白表达的检测将3组细胞培育48h，PBS漂洗3次后加入4℃的50μL裂解液，冰浴20min，12000g/min离心后取上清液.Bradford法测定蛋白浓度.取每种样品各40μg，100g/LSDSPAGE凝胶电泳分离，通过点转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜后在含有50g/L脱脂奶粉的TTBS中37℃封锁90min，加入1∶1000羊抗人Survivin（上海中山公司），4℃留宿，TTBS充分漂洗后加入1∶4000兔抗羊lgG/HRP（上海中山公司）,室温孵育1h，TTBS充分漂洗，洗膜后加入LumiGLO化学发光试剂作用1min.X线暗室曝光，常规显影定影.一样实验条件重复4次.图像以BioRad图像分析系统分析，用蛋白条带的平均光强度值表示Survivin表达的相对强度.

　　流式细胞仪观看肿瘤细胞凋亡细胞传代培育48h后，搜集10×106个细胞，分成10个样本，每一个样本1×106个细胞.用700mL/L的乙醇0℃固定，留宿，PBS洗涤并重悬细胞，加入PI染液1mL（EB10μg,PI50μg,RNaseⅠ酶10μg,枸橼酸钠5mg,TritonX100为μL，加生理盐水至1mL）,室温下孵育30min,流式细胞仪检测.观看亚二倍体峰的转变.凋亡率采纳上述样本的均值.结果以lysisⅡ软件分析.

　　细胞对多西他赛灵敏性分析（MTT）备96孔板，每孔加入100μL的1×105的Skov3，Skov3neo，Skov3SVVanti细胞，每种细胞加7孔，其中1孔做调零用，每孔依次加入0，1，10，20，50，100（μg/L）多西他赛，37℃培育48h后，每孔加入MTT（10g/L）10μL,培育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚枫（DMSO），振荡10min，酶标仪测定490nm处吸光度（A）值.依照A值计算细胞存活率并计算细胞生长抑制50%的多西他赛浓度，即IC50值.记录加多西他赛50μg/L后0，24，48，72h细胞生长曲线.上述实验重复三次，取均值.三组间IC50比较采纳采纳方差分析进行.

　　反义Survivin核酸对MDR1mRNA表达的阻碍上述3组细胞利用Trizol（Takara公司）法提取总RNA，RTPCR法扩增MDR1mRNA，进行比较.MDR1的上、下游引物别离为为：

5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′，扩增片段412bp.以βactin为内参照（上、下游引物别离为：

5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′,扩增片段127bp）.扩增产物用20g/L琼脂糖电泳，依照条带亮度的不同进行分析.MDR指数：

MDR值/βactin值.三组间MDR指数比较采纳方差分析.

　　2结果

　　重组质粒的构建和鉴定利用RTPCR方式从Skov3细胞克隆出Survivin基因，全长451bp，经电泳证明扩增片段与预先设计片段大小一致.与载体以AT策略连接后转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆酶切鉴定，再经上海生工公司测序与基因库中序列完全符合（图1），选取其中与反向连接者命名为antipcDNA3svv.由此取得真核表达载体.　　转染后稳固表达反义Survivin细胞克隆的获取阴性转染细胞在G418800mg/L浓度时死亡，阳性转染细胞渐形成单细胞克隆Skov3SVVanti（图2）.采纳胰酶定点消化的方式，将单细胞克隆洗脱到25mL细胞培育瓶，进行传代培育，培育成含有antipcDNA3svv的细胞株.

　　转染antipcDNA3svv对Skov3中Survivin蛋白表达的阻碍Westernbl