第一章 四川大学 DNA的分离纯化及测定Word格式文档下载.docx
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保证提取的DNA具有一定的长度
纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
排除有机溶剂和金属离子的污染
蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度
排除其他核酸分子的污染
3、基因组DNA-CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵，CetylTrimethylAmmoniumBromide）,是一种阳离子去污剂,
具有从低离子强度（0.3mol/LNaCl）溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性,
在高离子强度的溶液中（>
0.7mol/LNaCl）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl（三（羟甲基）氨基甲烷）（pH8.0）提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl提供一个高盐环境,有利于DNA双链的稳定；
CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除
CTAB提取缓冲液的改进配方
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;
同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.
（modifiedFromweb）
方法1
——液氮
——1×
缓冲液：
50mmol/LTris-HClpH8.0,
0.7mol/LNaCl,
10mmol/LEDTApH8.0,
1%CTAB,
20mmol/L2-巯基乙醇（用前加入）
——氯仿/异戊醇（24：
1）
——RNaseA:
2000U/mL用0.15mol/LNaCl,0.015mol/L柠檬酸三钠配10mg/mL;
使用前100℃热处理15min,除去残留的DNase活性
——异丙醇，
——76%乙醇，0.2mol/L乙酸钠
——70%乙醇
——TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTApH8.0,
操作程序
1.向装有700~800mg磨碎的干燥植物组织（冰冻干燥法，或用食品脱水器45℃~55℃用温暖干燥的气流对植物组织处理12h以上）（最好是去淀粉处理的：
收获之前将植株暗处理24h）的50mL聚丙烯离心管中加入20mL65℃预热的
1×
CTAB提取缓冲液。
轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，
65℃温育90min,并不时轻轻转动离心管。
或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至一50mL聚丙烯离心管中，然后加入20mL预热至90℃的2×
CTAB提取缓冲液（CTAB在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入到冷冻的材料中之前必须预热）。
轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃温育90min。
2．混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。
轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。
室温下5000g离心10min分相。
3．将上清液（水相）转移至一干净离心管中，加入1/100体积RNaseA贮液，颠倒混匀37℃保温30min。
4．加入0.7体积异丙醇，仔细混匀，室温放置15min沉淀DNA。
5．用一玻璃钩将DNA钩出（最适条件下，DNA-CTAB沉淀呈白色纤维状，很易钩出，若有多糖等杂质时呈絮状或胶状，需离心得到DNA-CTAB沉淀；
2%W/VPVP聚乙烯吡咯烷酮有助于去除多酚类杂质），并转移至一装有5mL76%乙醇，0.2mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置20min，然后转移至一装有5mL76%乙醇的离心管中冰上旋转5min。
6．将DNA转移至一干净离心管中，空气干燥15min，溶于尽可能少的TE缓冲液中（5mL左右）。
若要使DNA样品加速溶解并除去其中残留的DNase活性，可置于
65℃水浴加热10min。
4℃贮存。
方法2
CTAB（CetylTrimethylAmmoniumBromide十六烷基三甲基溴化铵）是一种去污剂．它能跟核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中可溶并且稳定存在、但如果降低盐的浓度（0.3mol/LNaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来。
而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中，通过离心将CTAB-核酸沉淀下来，然后溶于高盐溶液中，最后通过CsCl离心去除所有蛋白、多糖、寡聚核苷酸等不纯物。
抽提缓冲液（2×
）
CTAB（W/V）2%
Tris-HCl（pH8.0）100mmol/l
EDTA20mmol/l
NaCl1.4mol/l
巯基乙醇2%
10%CTAB溶液
NaCl0.7mol/l
CTAB10%
沉淀缓冲液
CTAB1%
Tris-HCl（pH8.0）50mmol/l
EDTA10mmol/l
巯基乙醇1%
CsCl梯度溶液（每梯度）
CsCl25g
TE缓冲液（pH8.0）25ml
溴化乙锭（（EB）5mg/ml
TE缓冲液:
Tris-HCl（pH8.0）10mmol/L
EDTA1mmol/L
异丙醇溶液：
向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现，然后边搅拌边加入固体CsCl，至下层TE相中出现白色沉淀，两相均匀待用
液氮
氯仿/异戊醇（24/1）
异丙醇
2%巯基乙醇
氯仿还能加速有机相与液相分层。
去除植物色素和蔗糖．在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。
最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的迹量酚。
实验程序
（1）取10g~50g新鲜植物材料，先置液氮中速冻半分钟，转至研钵中研磨成细粉末。
（2）将细粉末转至一个250ml的离心管中，先加入10~50ml的2%巯基乙醇，再加等体积的煮沸的抽提缓冲液（2×
），迅速混匀。
（3）将离心管置55℃水浴中保温，可轻轻搅动混合物，使离心管内温度达到50℃，然后让混合物降至室温。
（4）加等体积的氯仿/异戊醇（24/1），轻缓地颠倒混匀，室温下12000g离心10分钟，上清转至另一新离心管中。
（5）向离心管中加入1/10体积的10%CTAB溶液，再重复第4步一次。
（6）向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液，混匀，室温下放置至少30分钟，4000g离心10分钟，小心去上清，加CsCl梯度溶液，在50℃水浴中用枪头轻缓搅溶沉淀。
（7）将梯度溶液上到超速离心管中，平衡后封好管，在20℃，50000g条件离心过夜。
（8）在紫外灯下转移DNA带至一离心管中，加入等体积的异丙醇溶液，轻轻混匀后静置，分层后弃上层；
重复抽提几次，直至紫红色消失。
（9）加两倍体积的TE缓冲液，混匀后加等体积的异丙醇，-20℃放置1小时，4℃条件下12000g离心30分钟，沉淀溶于TE缓冲液中。
（10）向其中加入1/5体积的3mol/lNaAc（pH6.0）和3/5体积的异丙醇，混匀，在室温下放置5~10分钟，离心后沉淀溶于适量TE缓冲液中。
（11）用紫外分光光度仪检测DNA含量。
（8）是去除EB,异丙醇溶液也可用氯化钠饱和。
CTAB法提取真菌基因组DNA
2×
CTAB提取缓冲液（使用前在55or65oC预热）
2%（w/v）CTAB（HexadecyltrimethylammoniumBromide,Sigma#H-5882
=cetyltrimethylammoniumbromide）
100mMTris-HCl（pH8.0）
20mMEDTA（pH8.0）
1.4MNaCl
optional:
add1%mercaptoethanolbeforeusing（IusuallydonoaddMCE）
1取干菌丝（–80oC保存）放入研钵，加液氮后，研磨成粉末。
2将粉末转到离心管中，加入2×
CTAB提取缓冲液（使用前在55or65oC预热）。
（1g加20ml）。
365oC保温30min
4加入等体积氯仿：
异戊醇（24:
1），混匀，轻轻转动20min。
54,000rpm离心5min.
6取上清液于另一离心管，加RNaseA（5-50μg/ml）37oC保温30-60min。
7加入酚：
氯仿（1:
1），轻轻来回颠倒5min.
84,000rpm离心5min.4oC。
9加入等体积氯仿：
1），轻轻转动5min。
10取上清液于另一离心管，加入2倍体积100%乙醇或0.6-1×
异丙醇。
1110,000rpm离心10min.4oC
12.5-10ml70%乙醇洗一次。
13风干DNA，用DDWorTE缓冲液溶解。
三、细胞核、线粒体、叶绿体DNA的提取
1、细胞器差速分离：
2、从分离的细胞核中提取DNA
多酚类或多糖类含量较高的植物而言，用上述基本程序提取的DNA其纯度恐难以满足后续研究的要求。
一个解决办法就是在裂解之前将细胞核同其他大部分细胞质分开。
下述分离完整细胞核的方法（Henfrey和Slaterl988）,适用于新鲜的植物材料。
它包括选定对核膜伤害最小的条件破碎细胞，滤去细胞碎片，滤液经缓速离心富集细胞核。
从分离的细胞核中提取的DNA通常质量和纯度都较高，其中主要是核DNA，当然也可能混有一些细胞器DNA，特别是叶绿体DNA。
从分离的细胞核中提取DNA，得率较低，一般为10—20μg/g鲜重材料。
——核分离缓冲液（NIB）：
0.44mol/L蔗糖，2.5%Ficoll（相对分子质量400000），
5%Dextran40，25mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/L氯化镁，10mmol/L
2-巯基乙醇（用前加入）
——核裂解缓冲液：
10mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA,0.5%TritonX-100,pH7.2.
——Miracloth纱布
NIB:
nuclearisolationbuffer
Ficoll聚蔗糖
Dextran葡聚糖
Tritonx-100非离子型表面活性剂
步骤1~4中所需的试剂和仪器均须预冷至4℃以降低内源蛋白酶和核酸酶的活性。
1．将10g经去淀粉处理的新鲜材料剪碎，放入研钵中，加入10mLNIB磨碎匀浆。
2．匀浆用4倍体积NIB稀释后经双层Miracloth纱布过滤（Miracloth纱布预先用NIB浸湿）。
用5倍体积NIB冲洗Miracloth纱布上的残留物。
3．滤液分装于两个50mL聚丙烯离心管中，500g,4℃离心10min.弃上清。
4．用总体积20mLNIB重悬沉淀，合并，500g,4℃离心10min.弃上清。
5．用6mL核裂解缓冲液重悬上述细胞核粗沉淀，加入6mL预热至65℃的2×
CTAB提取缓冲液，轻轻旋转混匀，65℃保温1h,偶尔轻轻旋转。
6．以下操作按基本CTAB方法从第2步开始。
去淀粉处理：
收获之前将植株于暗处放置24h即可达到去除淀粉的目的。
3、叶绿体DNA的提取
分离植物叶绿体DNA的方法与分离核DNA的方法比较类似．也包括以下几个主要过程：
植物细胞的破碎，去除细胞核，然后用中速甩下叶绿体，经清洗和DNase处理后．即可用常规的沉淀核DNA的方法将叶绿体DNA沉淀下来。
细胞器分离缓冲液：
Sorbitol300mmol/l
Tris-HCl（pH8.0）50mmol/l
EDTA5mmol/l
BSA0.1%
β-巯基乙醇（V/V）0.1%
DNase缓冲液：
Sorbitol300mmol/l
Tris-HCl（pH8.0）50mmol/l
EDTA5mmol/l
β-巯基乙醇（体积比）0.1%
MgCl213mmol/l
DNaseI250μg/ml
细胞器清洗缓冲液：
NaCl150mmol/l
EDTA（pH8.0）25mmol/l
裂解缓冲液：
Tris-HCl（pH7.2）50mmol/l
EDTA20mmol/l
Sarkosyl溶液：
Tris-HCl（pH7.2）50mmol/l
Sarkosyl20%
0.5mol/lEDTA（pH8.0）
52%和30%蔗糖
Sorbitol山梨醇sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂
牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。
（1）将一定量的植物叶片剪成小片（愈伤组织切割成小块），置于400ml预冷的细胞器分离缓冲液中．用匀浆器以中等速度匀浆1—2分钟，然后将匀浆液用4层灭菌的纱布和1层Miracloth过滤至一灭过菌的1升烧杯中。
（2）将过滤后的匀浆液移至离心管中，以700g的速度4℃条件下离心10分钟，去沉淀；
上清移至另一离心管中，4℃条件下2000g离心10分钟，去上清。
（3）将沉淀悬浮于25mlDNase缓冲液中，冰上放置1小时．加0.5mol/lEDTA溶液至终浓度为20mmol/l，然后在4℃条件下2000g离心15分钟。
（4）将沉淀悬浮于30ml细胞器分离缓冲液中，待用．
（5）用50ml离心管制4个蔗糖梯度，每一梯度的制法为：
底都为18ml的52％蔗糖、50mmolTris-HCl（pH8.0）和25mmolEDTA混合液，上面盖上7ml30％蔗糖、50mmolTris-HCl（pH8.0）和25mmolEDTA混合液。
（6）将第4步中悬浮的沉淀7.5ml小心地分别上于一个梯度离心管中，平衡后以
25000r/min速度在4℃离心30分钟。
（7）用宽口大枪头从52—30％蔗糖界面上吸取叶绿体条带，置于250ml烧杯中。
缓缓地用三倍体积的预冷的细胞器分离缓冲液稀释，然后将液体移置适当大小的离心管中，4℃条件下以2000g离心15分钟。
（8）沉淀悬浮于25ml细胞器清洗缓冲液中，4℃条件下以2000g离心15分钟。
（9）将每份沉淀悬浮于5ml裂解缓冲液中，在水上边摇晃边滴入20％的Sarkosyl溶液，至终浓度为1％。
（10）将裂解的叶绿体上一个CsCl/EtBr密度梯度，即可获得较纯的叶绿体DNA。
4、植物线粒体DNA的分离
分离植物线粒体DNA，首先就要分离出线粒体，然后再从线粒体中分离DNA。
提取的过程主要包括破碎细胞、差速离心、梯度离心、盐沉淀等。
1mol/lCsCl/EtBr溶液
CsCl1mol/l
EtBr0.2mg/ml
7mol/lCsCl/EtBr溶液
CsCl7mol/l
Sarkosyl0.1%
CsCl饱和的异丙醇
0.5mol/l的EDTA溶液（pH8.0）
3mol/lNaAc
实验程序:
（1）将一定量的植物叶片剪成小片（愈伤组织切割成小块），置于400ml预冷的细胞器分离缓冲液中．用匀浆器以中等速度匀浆1—2分钟，然后将匀浆液用4层灭菌的纱布和1层Miracloth过滤至一灭过菌的1升烧杯中。
（2）将过滤后的匀浆液移至离心管中，以700g的速度4℃条件下离心10分钟，去沉淀；
上清移至另一离心管中，4℃条件下2000g离心10分钟，再去沉淀，上清再移至另一离心管中、4℃下以10000g速度离心15分钟，去上清。
（3）将沉淀悬浮于25mlDNase缓冲液中，冰上放置1小时．加0.5mol/lEDTA溶液至终浓度为20mmol/l，然后在4℃条件下10000g离心15分钟。
（4）沉淀用25ml冲洗缓冲液悬浮．并再次在4℃条件下10000g速度离心15分钟．
（5）沉淀用5ml裂解缓冲液悬浮．置冰上．然后向其中滴入20％的Sarkosyl溶液至终浓度为1％，4℃条件下500g低速离心5分钟．上清移至一离心管中。
（6）先向离心管中加入一定量的1mol／lCsCl/EtBr，55℃水浴中保温5分钟，然后加入前者体积1.2倍的7mol／lCsCl/EtBr将离心管盖好封上，缓慢倒置混匀。
（7）以40000r/min速度在4℃离心16小时或更长，在320nm紫外光下观察DNA带，在DNA带管壁旁用单面刀片划一道小口子，然后用带针头的注射器穿刺进去．抽出DNA带。
（8）加入等体积的CsCl饱和的异丙醇去除EtBr，水相再置于透析袋中4℃透析24小时以上．2升的去离子水至少换三次．并用磁力搅拌器搅拌。
’
[9）在260nm测A值．计算DNA样品的量。
加入0.1体积的3mol/lNaAc和2体积冷的无水乙醇．置-20℃过夜。
（10）10000r／min离心10分种，沉淀经真空抽干后溶于适量体积的水中，电泳检查。
《植物基因与分子操作》顾红雅1995年04月第1版
四、质粒DNA的提取
碱变性质粒DNA抽提法
碱变性质粒DNA抽提法是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异来达到分离质粒DNA的目的的。
在强碱条件下．染色体DNA氢键断裂．双螺旋结构解开而变性；
质粒DNA大部分氢键也断裂，但由于其螺旋共价闭合环状的结构．两条互补链不会完全分离、当体系的pH从碱性调至中性时，两条链即复性，质粒DNA即以原来的构型保存在溶液中.
而染色体DNA不能很快复性，只能形成缠连在一起的网状结构；
这时一离心，染色体DNA就与不稳定的大分子RNA、蛋白质——SDS复合物等杂质一起沉淀下来而被除去。
质粒DNA在溶液中以水合状态稳定存在，用乙醇沉淀的方法即可获得纯的质粒DNA。
如果要提高质粒DNA的纯度、最好再在提取过程中加上加RNase降解小分子RNA、加苯酚氯仿抽提蛋白和加PEG沉淀等步骤。
大致可分为从菌体染色体DNA中分离质粒DNA、去除RNA和去除蛋白质等杂质三大步骤，实验中采用的各种试剂成分均有其生化功能。
溶液I：
溶菌酶用于水解菌体细胞壁的主要化学成分，具有溶菌作用。
葡萄糖是为了增加溶液粘度，以防止染色体DNA受机械剪切力作用而降解、污染质粒。
EDTA一是抑制DNase对DNA的降解作用，因为EDTA是一种金离子鳌合剂，DNase作用时却需要一定的金属离子作辅基；
二是保证溶菌酶有一个良好的低离子强度的环境。
溶液II：
NaOH可促使染色体DNA及质粒DNA强碱变性。
SDS则是表面活性剂，功能是破坏膜、解聚核蛋白以及形成蛋白质变性复合物以利于沉淀。
溶液IIIKAc—HAc缓冲液．它使变性的质粒DNA复性并稳定存在。
葡萄糖50mmol/l
Tris-HCl（pH8.0）25mmol/l
溶菌酶4mg/ml
溶液II（新配制）：
NaOH0.2mol/l
SDS1%
溶液III（100ml,pH4.8）：
KAc29.4g
冰醋酸11.5ml
水加至100ml
EDTA（pH8.0）1mmol/L
RNase（10mg/ml）
无水乙醇和70%乙醇
异丙醇
4mol/LNaCl
13%PEG8000
[实验程序]
（1）取单个细菌菌落接种到5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜。
（2）取1.5ml×
3培养液至Eppendorf管中，7000g离心2分钟，去上清液。
（3）将沉淀菌悬浮于200μl预先冷却的溶液I中，混匀后开盖在室温下放置5分钟。
（4）向管中加入300μl新配制的溶液II，盖上盖子迅速颠倒小管2—3次混匀，冰上放置5分钟。
（5）加入300μl溶液III，盖上盖子倒置温和振荡10秒钟，冰上
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