二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响.docx

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二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响

二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响

作者：

黄忠仕，黎昀，黄健，李曙波，农嵩

【摘要】目的观察二苯乙烯苷（TSG）对SAMP8鼠脑组织胆碱能神经递质及单胺类神经递质含量的影响。

方法选用6月龄的SAMP8鼠50只，随机分为5组，SAMP8对照组、阳性药石杉碱甲对照组、TSG低、中、高剂量组，每组10只。

另选用6月龄SAMR1鼠10只作正常对照组。

各组分别灌胃相应药物50天后，采用分光光度法检测各组小鼠脑组织胆碱乙酰转移酶（ChAT）和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性，高效液相色谱法检测各组小鼠脑组织去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5羟色胺（5HT）含量。

结果SAMP8对照组脑组织ChAT活性明显降低，AchE活性明显升高，NE、DA、5HT的含量明显降低，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.05或0.01）；TSG中、高剂量组ChAT活性显著升高，TSG各剂量组AchE活性显著降低（P＜0.05或0.01），NE、DA、5HT含量均得到提高，与SAMP8对照组比较，差异具有显著性（P＜0.05或0.01）。

结论二苯乙烯苷可有效促进乙酰胆碱（Ach）的合成及减少乙酰胆碱的分解，促进单胺类神经递质的合成，具有良好的抗痴呆的作用。

【关键词】二苯乙烯苷；老年性痴呆；胆碱能神经递质；单胺类神经递质

【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectofTSGoncholinergicneurotransmitterandmonoamineneurotransmittercontentsinSAMP8mice'sbrain.Methods50miceof6month'soldwithSAMP8wererandomizeddividedto5groups（10ineachgroup）:

SAMP8group,huperzineAcontrolgroup,low,midandhighdosegroupsofTSG.Another10micewereassignedtonormalcontrolgroup.Aftermedicationfor50days,theactivityofChAT,AchEinmice'sbrainineachgroupweredetectedbyspectrophotometry.TheNE,DAand5HTcontentsinbrainweredetectedbyHPLC.ResultsTheactivityofChATdecreasedandtheactivityofAchEenhancedsignificantly,andtheNE,DAand5HTcontentsdecreasedsignificantlyinSAMP8mice'sbraincomparingwithnormalgroup（P＜0.05or0.01）.InTSGtreatmentgroup，theactivityofChATenhancedandtheactivityofAchEdecreasedsignificantly,andtheNE,DAand5HTcontentsincreasedsignificantlyinmice'sbraincomparingwithSAMP8group（P＜0.05or0.01）.ConclusionTSGcaneffectivelypromotethesynthesisofacetylcholineandreducethedecompositionofacetylcholine,promotethesynthesisofmonoamineneurotransmitter,resultinginthesatisfactoryantidementiaeffects.

【Keywords】2,3,5,4′tetrahydroxystilbene2OβDglycoside（TSG）;alzheimerdisease;cholinergicneurotransmitter;monoamineneurotransmitter

阿尔茨海默病，即老年性痴呆（alzheimereisease,AD）是危害老年人身心健康的常见病、多发病。

目前该病的发病机制尚未明确，研究发现AD与脑内多种神经递质密切相关［1，2］。

二苯乙烯苷（2,3,5,4'四羟基二苯乙烯βD葡萄糖苷，TSG）是何首乌中的主要水溶性成分，近年来发现其具有神经保护作用，对老年性痴呆的防治具有很好的应用价值［3，4］。

本实验从何首乌提取TSG成分，以SAMP8（senescenceacceleratedmouseprone/8，快速老化小白鼠）为老年性痴呆动物模型，考察二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响，报道如下。

　　材料和方法

　　1.动物

　　SAMP8和SAMR1（senescenceacceleratedresistantmouse/1,正常老化小白鼠）雄性小鼠由天津中医学院第一附属医院提供（实验动物质量合格证号：

WJ津实动质M准字第006号），SPF级，体重24～28g。

2.主要试剂

　　ChAT（胆碱乙酰转移酶）、AchE（乙酰胆碱酯酶）、T.P（总蛋白）测试盒由南京建成生物工程研究所提供。

标准品：

去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5羟色胺（5HT）标准品（Sigma公司生产）；流动相：

甲醇、乙腈（天津市四友精细化学有限公司生产，批号：

Q/SHIELD0022000）；磷酸氢二钠（广东合山化工厂生产，批号：

20060801）；样品前处理试剂：

高氯酸（广东爱廉化试剂有限公司生产，批号：

060508）；阳性对照药：

石杉碱甲（豫中制药厂生产，批号：

H10940156）；二苯乙烯苷（由右江民族医学院生化教研室根据有关文献［5，6］提取，纯度为73%）。

3.实验仪器

　　TU1800SPC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RA50半自动化分析仪（BayerDiagnosticsMfg.Ltd）；FJ200高速分散匀质机（上海标本模型厂）；Waters1525高效液相荧光检测器（美国Waters公司）；C18（4.6×250　mm，5　μm）色谱柱（Agilent公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

4.方法

（1）动物分组与给药

　　选择6月龄SAMP8雄性鼠50只，随机分为SAMP8对照组、阳性药石杉碱甲对照组、TSG低剂量组、TSG中剂量组、TSG高剂量组，每组10只。

另外选择6月龄SAMR1雄性鼠10只，作为SAMRl对照组。

各组均按0.2ml/10g体重给药。

SAMP8对照组、SAMRl对照组：

生理盐水，30　ml·kg-1；阳性药对照组：

石杉碱甲0.02mg·kg-1；TSG低剂量组：

TSG0.033g·kg-1；TSG中剂量组：

TSG0.1g·kg-1；TSG高剂量：

TSG0.3g·kg-1。

以上各组每日灌胃给药l次，连续50天。

（2）标本采集

　　第50天给药1小时后处死小鼠，同时迅速剥离小鼠脑组织于4℃预冷的生理盐水漂洗除去血液，用滤纸吸干多余水分，分离左右半脑并分别称重，左半脑用于ChAT、AchE、T.P测定，右半脑用于NE、DA、5HT测定。

（3）ChAT、AchE、T.P的测定

　　分取出各组小鼠左半脑，分别加入9倍体积的冰生理盐水，用高速分散匀质机制成10%的脑匀浆，3000r·min-1离心10min，取上清液待测。

按试剂盒操作说明分别对各组小鼠脑匀浆上清液进行ChAT、AchE、T.P测定。

各组小鼠ChAT、AchE活性除以相应的T.P含量作为ChAT、AchE的单位。

（4）单胺类神经递质标准曲线的制备

　　精密称取NE、DA、5HT标准样品各0.01mg，分别用流动相定容于5ml容量瓶中，制成0.002g·L1的NE、DA、5HT的贮存液。

按需要稀释成各种浓度进样，每次进样20μl，以进样浓度（X，μg·L-1）对峰面积（Y）进行线性回归。

（5）单胺类神经递质测定方法

　　取出各组小鼠右半脑，分别加入9倍量（重量/体积比）5%HClO4，超声粉碎成10%匀浆,冷冻高速离心14000r·min-115分钟，取上清液进样20μl。

记录各样品的峰面积，代入相应标准曲线计算出相应浓度，统计结果。

色谱条件：

色谱柱为WaterssymmetryC18（4.6×250　mm，5　μm）；流动相A：

磷酸盐缓冲液；流动相B：

甲醇；时间与流速：

0～10min0.5ml·min-1，10～14min1.0　ml·min-1，14～22.5min1.5ml·min-1，22.5～30min0.5ml·min-1；A和B泵的比例：

90∶10；AUFS：

0.01；波长：

激发波长254nm，发射波长338nm；柱温：

35℃。

5.统计学处理

　　采用SPSS11.0统计软件包统计分析，计量资料以均数±标准差（-±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.二苯乙烯苷对ChAT和AchE活性的影响与SAMR1对照组相比，SAMP8对照组ChAT活性明显降低，AchE活性明显升高（P＜0.05）。

与SAMP8对照组相比，TSG中、高剂量组ChAT活性显著升高，TSG各剂量组AchE活性显著降低（P＜0.05或0.01）。

与阳性药对照组比较，TSG各剂量组无显著性差异（P＞0.05）。

见表1。

表1二苯乙烯苷对ChAT和AchE活性的影响（略）注：

与SAMR1对照组比较，ΔP＜0.05；与SAMP8对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.NE、DA、5HT含量的标准曲线制备

　　根据标准曲线求得其回归方程为：

Y=515.6X-38171.9，Y=329.3X-34557.2和Y=342.4X+534.5；线性范围分别125～2000μg·L-1，125～4000μg·L-1和10～500μg·L-1。

3.二苯乙烯苷对三种单胺类神经递质含量的影响

　　与SAMR1对照组和阳性药对照组相比，SAMP8对照组动物NE、DA、5HT含量水平明显下降（P＜0.05或0.01）。

与SAMP8对照组相比，二苯乙烯苷各剂量组能明显升高NE、DA、5HT水平（P＜0.05或0.01），其中以高剂量组作用更明显（P＜0.01）。

见表2。

表2二苯乙烯苷对三种单胺类神经递质含量的影响（略）注：

与SAMR1组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与SAMP8组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

　　讨论

　　AD是一种以认知功能下降为特征的神经退行性病变，累及多种神经递质系统，其中胆碱能系统活性下降是引起AD痴呆表现的重要原因之一。

研究表明，AD脑内隔区、Meynert基底核等部位的胆碱能神经元明显减少，AD患者脑内乙酰胆碱（Ach）合成分泌减少，其合成酶ChAT活性下降，且与痴呆严重程度密切相关［7，8］。

AchE是催化Ach水解的主要生物酶，研究证实AD脑内一方面正常神经元内AchE活性降低，另一方面，神经纤维缠结（NFT）和老年斑（SP）内游离于神经元外的AchE活性显著提高，它们