单元2消毒灭菌技术Word下载.docx

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微生物学，中国医药科技出版社，1999。

【3】李榆梅主编：

药学微生物实用技术，中国医药科技出版社，2008。

作业

目标测试题

课后体会

学生对灭菌设备很感兴趣，积极操作但对于灭菌方法的判断还需学习。

授课主要内容或板书设计

学习项目1消毒灭菌方法及设备的认识

【引入】

本章需要掌握的基本技能是掌握控制微生物生长的消毒、防腐与灭菌方法及所用设备。

首先解决以下几个问题：

消毒、灭菌、防腐、化疗、无菌、无菌技术等基本概念的含义是什么？

物理消毒灭菌的常用方法及设备有那些？

化学消毒、灭菌、防腐的常用方法有那些？

要想达到好的控制微生物生长繁殖的效果应考虑那些影响因素？

一、消毒、灭菌、防腐、无菌、无菌技术等基本概念的含义是什么？

消毒：

指杀死病原微生物，但不包括芽胞。

灭菌：

是指杀灭物体上所有微生物，包括繁殖体和芽胞。

防腐：

是指防止或抑制微生物生长繁殖。

消毒剂：

高浓度

防腐剂：

低浓度

无菌：

物品中没有活的微生物存在。

无菌技术：

是指在进行外科手术或分离、转种及培养时防止其他微生物污染实验材料的操作方法。

无菌操作所用的器具和材料，都必须先经灭菌处理。

二、物理消毒灭菌的常用方法有那些？

热力灭菌法：

高温、低温、干燥

辐射杀菌法：

电离、非电离

物理方法 

滤过除菌法

超声波杀菌法

等离子体

渗透压

（一）、热力灭菌法

分类：

干热灭菌法

湿热灭菌法

1.干热灭菌法

A焚烧与烧灼：

灭菌

焚烧其作用范围为污染纸张、垃圾等废弃物及动物尸体等；

灼烧一般用于可直接加热的仪器、器皿的灭菌，例如接种环、手术刀、镊子等金属器械及试管、三角瓶、小烧杯等。

注意事项如下。

（1）灼烧时要用酒精等外焰加热。

（2）灼烧接种环时，要不停捻动接种环的棒部，以便受热均匀，先烧环部，烧红、烧透，再烧柄部。

（3）灼烧试管、三角瓶、小烧杯等玻璃器皿时，要用灼烧过的镊子夹住仪器口壁，然后使器皿口朝上倾45º

，用酒精灯外焰从底部依次向上均匀加热（注意仪器内不能有水存留），最后烧灼管口、瓶口。

（4）纸片等易燃物品用灼烧法灭菌时，用无菌镊子夹住纸片，迅速在酒精灯外焰移动，以杀死微生物（注意纸的两侧应均匀灼烤），切忌烤糊。

B、干烤：

灭菌160°

～180℃，2h；

利用热辐射及干热空气进行灭菌，常用仪器是恒温干燥箱和干热灭菌箱。

使用恒温干燥箱的注意事项

（1）对玻璃器皿、瓷器、金属等耐热物品灭菌时，首先要洗干净、控干水，不能沾有油脂等有机物。

按要求包扎好后，放人恒温干燥箱内，排列不可过密、不可紧靠干燥箱壁，且忌用油纸包扎，以防着火。

然后调节温度到160～170℃持续2h以上，温度不要超过170℃。

（2）一般情况下对注射器、安瓿等灭菌时，180℃45min即可。

用l80℃2h或250℃45min可除去热原质。

（3）对纸张、棉花等物品及凡士林、部分粉剂等药品灭菌可用140℃，持续3h。

（4）灭菌时，干燥箱内物品不能堆放过多、过密，以防空气不易流通。

用纸包扎的待灭菌物，不可紧靠干燥箱壁，以防着火。

（5）灭菌开始前要调节好温度、时间，关好箱门，待温度慢慢升高。

灭菌结束时，关闭电源，温度慢慢降至60℃左右再开启箱门，以免高温度的玻璃因骤冷而破碎。

（6）干燥箱内有焦糊味应立即关闭电源，报告教师。

（7）取出灭菌物品时，小心不要碰破电热干燥箱顶部放置的温度计。

水银温度计打破后，立即报告老师，一定及时处理，防止水银蒸发中毒。

可先用硫磺铺撒在污染的地面和仪器上，然后用吸管清除水银。

C、红外线灭菌：

2.湿热灭菌法

A巴氏消毒法：

61.1-62.8℃，30min；

71.7℃，15-30sec 

B煮沸消毒法：

100℃，5min-10min

C流通蒸气消毒法：

100℃，15-30min 

D间歇蒸汽灭菌法：

100℃，15-30min，37℃过夜（3次）

E高压蒸气灭菌法:

高压蒸汽灭菌法是彻底而迅速的灭菌法。

适用范围：

①耐高温和潮湿的物品，如培养基、衣物、敷料、玻璃器材、传染性污染物等；

②接种及培养后的培养基，经高压蒸汽灭菌后，再弃去，然后洗涤相应容器。

高压蒸汽灭菌法需要的设备为：

高压蒸汽灭菌器。

高压蒸汽灭菌器的工作原理：

常压下，水的沸点是l00℃，随着容器里的压力升高，水的沸点也将升高，因此可以提高蒸汽的温度，人为使容器内的压力持续一定的时间，可达到彻底灭菌的目的。

使用高压蒸汽灭菌器要按要求操作，特别注意安全事项。

1.使用高压蒸汽灭菌器注意事项

（1）加水使用高压蒸汽灭菌器应注意仪器内水量充足，加水达到标识线。

（2）加料把灭菌物品疏松排列在高压蒸汽灭菌器内，保证空气畅通。

被灭菌的容器表面必须洁净且不污染有机物质，并用一定方法包扎，防止脱落。

盛装液体制剂的容器要耐高温、高压，并且保证器皿盖上有通气孔，使容器内外相通，如：

灭菌生理盐水时，在瓶盖上插一注射器针头可达容器内外气体相通的目的，保证容器不会因高压而损坏。

（3）加盖盖好灭菌器盖，拧紧加压装置，检查放气阀和安全阀，全自动仪器要设置好压力、温度、时间。

（4）排放冷空气加压之前先排除仪器内的冷空气，待灭菌器内有白色蒸汽持续冒出时，关上放气阀（全自动装置可忽略此环节）。

（5）灭菌实验室中常用的方法是：

I21.3℃，持续20min，可达到较好的灭菌效果。

不能耐受l21℃的含糖培养基或注射液可用116℃，持续40min或更长的时间达灭菌目的。

也可用126.5℃，15min达灭菌目的。

（6）开盖取物高压蒸汽灭菌结束时不要急于打开锅的压力阀，要等仪器内外压力平衡后（压力表将为零时）再打开压力阀，以免锅内液体喷溅伤人及灭菌器皿破裂。

（7）严密监控灭菌时不能离开工作现场，控制好灭菌压力，以防压力过高破坏培养基成分，防止高压锅超过耐压范围时爆炸伤人。

思考：

湿热比干热灭菌好的原因：

（1）细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性

（2）湿热穿透力强

（3）湿热蒸气有潜热存在，水蒸气凝固成水释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度

（二）、光线与射线的消毒作用

1．日光与紫外线

　机理：

损坏DNA构型->

细菌死亡或变异

特点：

穿透力弱

2．电离辐射：

包括X射线和γ射线

机制：

干扰DNA的合成；

破坏细胞膜；

产生过氧化氢等 

穿透力强，不升高温度

（三）、滤过除菌法 

用滤菌器除去液体及空气中的细菌

用于不耐热的血清、毒素、抗生素

（四）、超声波的消毒作用

可裂解细菌，尤其对G+更敏感 

主要用于粉碎细胞，提取细胞组分或制备抗原等

（五）等离子体法

对微生物有良好的杀灭作用。

但不适用于纺织品和液体。

三、化学消毒灭菌的常用方法有那些？

消毒剂

防腐剂

化学方法化学治疗剂

（一）化学消毒灭菌的机制

①使菌体蛋白质变性或凝固

②破坏或改变蛋白质与核酸功能基团

③改变细胞壁的通透性

（二）常用消毒剂的主要种类、浓度及用途

1．酚类：

作用：

菌体蛋白凝固；

损伤细胞膜；

灭活酶类浓度：

石炭酸为3%-5%、来苏儿为2%

用途：

地面、器具表面和皮肤的消毒

2．醇类：

作用机制：

使菌体蛋白变性与凝固；

干扰细菌代谢

浓度：

乙醇70%-75%用途：

用于皮肤的消毒和体温计等的浸泡

3．重金属盐类：

使细菌发生变性和沉淀；

酶活性丧失

（1）2%红汞：

皮肤、粘膜和小创伤 

（2）0.05-0.01%升汞：

非金属器皿

4．氧化剂：

氧化作用；

使蛋白质变性

（1）0.1%高锰酸钾：

皮肤、尿道、水果

（2）3%过氧化氢：

创伤、皮肤粘膜

（3）2%-2.5%碘酒：

皮肤消毒

（4）0.2ppm-0.5ppm氯：

饮水和游泳池 

（5）10%-20%漂白粉：

地面、厕所等

5．表面活性剂：

灭活氧化酶等酶的活性；

蛋白质沉淀

（1）0.05%-0.1%新洁尔灭：

皮肤粘膜、手术器械

（2）0.05%-0.1%杜灭芬：

伤口冲洗，金属器械、塑料、橡皮类

6．烷化剂：

使菌体蛋白和核酸的烷基化

（1）10%甲醛：

物品表面、空气

（2）2%戊二醛：

精密仪器、内窥镜等缺点：

有一定的毒性

（三）日常消毒剂的应用

1．病人的排泄物：

等量的20%漂白粉、5%石炭酸或2%来苏儿、搅拌均匀，作用2小时

2．皮肤：

2.5%碘酒、70%酒精、2%红汞

3．粘膜：

1%硝酸银、3%过氧化氢、0.1%高锰酸钾等

4．饮水:

氯气、漂白粉

5．厕所：

生石灰

6．空气：

甲醛熏蒸

7．手：

2%来苏儿、2%碘酊、70%酒精

（四）常用防腐剂

1.概念：

可抑制霉腐微生物的生长繁殖，防止食品等发生霉变的措施，此时，微生物并没有被杀灭，而只是受到抑制。

而添加防腐剂也是一种常用的防腐措施。

2.常见防腐剂：

乳酸链球菌肽 

，又称乳酸链球菌素，苯甲酸和苯甲酸钠；

硝酸盐和亚硝酸盐等。

四、影响消毒灭菌的因素

a.消毒剂的性质、浓度与作用时间

b.微生物的种类与数量

c.温度

d.酸碱度

e.有机物

五、分组讨论

判断下列物品采用何种消毒灭菌方法较为合适？

这些消毒灭菌方法分别需要什么设备或试剂？

如何操作?

接种环、牛奶、酶制剂、实验服、无菌室、培养皿、饮水、皮肤、一般培养基

微生物实训室

2

学习项目2微生物实验器具的基本清洗包扎技术

技能目标1．能安全配制出符合要求的洗涤剂并正确使用

2．能熟练、迅速地包扎好各种玻璃器皿

具体的操作及注意事项

包扎的正确操作

演示法、分组讨论和分组实训法

移液管、培养皿等仪器

微生物实训手册

实训报告

对于玻璃仪器的包扎需要反复练习，个别同学接受能力欠缺，需

要加强联系。

【复习引入】上一个学习项目为消毒灭菌，那么在消毒灭菌之前我们要对各种器皿进行清洗包扎，那么如何进行清洗包扎就是本次学习的主要任务。

一、常用洗涤液及其配制方法

（一）配制洗涤剂的常用试剂

重铬酸钾（工业用）、浓硫酸、氢氧化钠溶液（0.1mol/L）、碳酸钠水溶液（苏打水）、氨水、酒精（95％）、苯酚溶液（0.5％，5％）、浓硝酸、漂白粉液、蒸馏水、肥皂、氢氧化钾溶液（0.1mol/L）、盐酸溶液（10％，0.1mol/L）。

1．铬酸洗涤液的配制与使用

（1）配方

浓配方：

重铬酸钾（工业用）40g稀配方：

重铬酸钾（工业用）50g

浓硫酸（粗）500mL浓硫酸（粗）lOOmL

自来水160mL自来水850mL

（2）配制与使用方法

将重铬酸钾溶解在自来水中，慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，配好后，贮存于广口的玻璃瓶内，盖紧塞子备用。

应用此液时，器皿必须干燥，同时切忌把大量还原物质带入，这样就可应用多次，直到溶液呈青褐色为止。

在使用时，为增加去污作用，稀的铬酸洗涤液可以煮沸使用。

2．酸和碱的配制及使用

若器皿上沾有焦油和树脂等物质，可用浓硫酸或40％的氢氧化钠溶液使它们溶解后洗去，一般只需5～10min，有时需数小时。

3．肥皂和其他洗涤剂的使用

肥皂水是很好的去污剂，加热后去污力更强。

油脂太多的器皿，先用吸水纸将油擦去后，再用肥皂水洗。

此外还有其他洗涤剂如l0％的磷酸钠溶液去污、去油脂能力更强。

比用肥皂洗更加洁净。

二、玻璃器皿的准备与清洗

1．新购置的器皿

对于新购置的玻璃器皿最好的清洗办法是用l0％的盐酸溶液浸泡一夜再用清水洗净；

也可浸在肥皂水中lh，再用清水洗净。

2．一般器皿

（1）一般器皿如试管、烧杯、培养皿等，若沾有有害微生物，先用高压灭菌锅灭菌或用漂白粉溶液消毒后，再用水洗。

（2）用肥皂水洗时，可以加热煮沸，洗过之后用清水冲洗几次，最后用少量蒸馏水洗一次，器皿干燥后就会更加洁净、光亮。

（3）若需更洁净的器皿，可用浓铬酸洗液处理。

试管、烧杯、培养皿等在铬酸洗液中浸10min，滴定管、吸管和移液管则要1～2h。

洗液处理后的玻璃器皿，要用水充分冲洗，将洗液完全洗去，最后用少量蒸馏水再洗一次。

3．载玻片与盖玻片

已用过的带有活菌的载玻片与盖玻片，可先浸在5％的苯酚溶液中消毒，然后用水冲洗干净，水洗后在铬酸洗涤液中浸数小时后再用水洗几次。

若载玻片和盖玻片上沾有油脂等物质，可先用肥皂水煮过后再洗。

洗净的载玻片与盖玻片，可贮在95％的酒精（滴入少量浓盐酸）中，用时可用柔软洁净的布擦干或将酒精烧去。

4．滴定管、吸管和移液管

带菌的滴定管、吸管和移液管等，应立即投入5％苯酚溶液中过夜，先进行灭菌。

然后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲净。

不带菌的可直接清洗。

5．特殊清洁法

精密的实验，只将玻璃表面附着物洗去还不够，玻璃中的可溶性杂质也影响实验验结果。

这些玻璃器皿，可先在0.1mol/L的氢氧化钾溶液或0.lmol/L的氢氧化钠溶液中煮1h，洗过后再在0.1mol/L的硫酸或0.1mol/L的盐酸溶液中煮1h。

然后再用蒸馏水洗几次，再在蒸馏水中浸几小时后干燥。

三、玻璃器皿的干燥

洗净后的玻璃器皿，一般是放在木架上或其他合适的地方，在室温下干燥。

若需要高温干燥，温度一般在80～100℃为宜。

压缩空气吹干比较快，但压缩空气不太洁净，需要很干净的器皿时不宜用。

若需快速干燥，可将洗净的玻璃器皿先用少许无水酒精润湿，倒去后再加少许乙醚，任其干燥。

四、玻璃器皿的包扎

洗净的玻璃器皿，有些还需在电烤箱中进行干燥，灭菌前需要包扎。

1.培养皿

培养皿可单独用纸包装，也可几套培养皿一起用纸包装。

2.试管、烧杯、锥形瓶

试管、锥形瓶先加棉塞，烧杯口加盖6～8层纱布，最后用纸包扎后在电烤箱中进行干热灭菌。

3.移液管

为防止细菌进入口中，并避免将口中细菌吹入移液管内，移液管应在距管口1～2mm处用铁丝塞入棉花少许（约4～5cm长）。

棉花要塞得松紧适宜，吹时能通气但棉花不滑下去。

将塞好棉花的移液管尖端，放在4～5cm宽的纸条一端约成45º

角，折叠纸条包住尖端，用左手捏住移液管，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，每只移液管分别以螺旋式包扎起来。

上端剩余纸条折叠打结，放在电烤箱中准备灭菌（图1-5）。

四、教学组织：

实训2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。

五、总结与评价：

采用同学之间的评价、示范和老师的综合评价。