细胞生物学实验手册Word格式.docx
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实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察……………………（11）
实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察……………………………………（13）
实验六细胞生理活动的观察……………………………………………………（16）
实验七细胞组分的化学反应……………………………………………………（20）
实验八细胞核与线粒体的分级分离……………………………………………（23）
实验九细胞分裂的形态观察……………………………………………………（26）
实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备……………………………（31）
实验十一细胞融合…………………………………………………………………（36）
实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本…………………………（38）
实验十三培养细胞的形态观察和计数……………………………………………（40）
实验十四细胞的原代和传代培养…………………………………………………（43）
实验十五酸性磷酸酶的显示………………………………………………………（46）
实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定……………………………………（48）
实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察………………………………………（50）
实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察………（54）
实验十九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原……………………………………（56）
实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析……………………………………（58）
实验二十一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察……………………（60）
实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察……………………………………（63）
实验二十三细胞显微摄影…………………………………………………………（65）
附录一离心机转数与离心力的换算表………………………………（67）
附录二溶液的配制……………………………………………………（68）
主要参考资料……………………………………………………………（77）
实验室规则
一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。
实验中途因故需外出时应向任
课教师请假。
二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。
三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。
四、必须严肃认真地进行实验。
实验期间不得进行任何与实验无关的活动。
五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。
要爱护仪器、标本和设
备。
如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱修。
损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。
六、注意节约实验材料、药品和水、电等。
七、保持实验室内清洁整齐。
实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材
清洗后点清数目，然后摆放整齐。
班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关
和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。
八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。
九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。
常用实验动物的了解和解剖器械的使用
一、常用实验动物
常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。
在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。
例如，蟾蜍可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验（如药物的半数致死量的测定等），猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。
在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。
蟾蜍
蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。
其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。
1．雌雄鉴别
通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。
2．捉拿及处死方法：
常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。
具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。
在头与躯干之间可触及一凹陷（即枕骨大孔所在处），右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。
然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。
如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。
小白鼠
小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。
1．捉拿方法：
将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。
用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。
2．处死方法：
处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。
常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。
断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。
颈椎脱位法的具体方法是：
左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。
3．给药方法：
小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。
我们常用的是腹腔注射。
具体方法是：
左手捉住小鼠（如前所述），在其腹正中线稍外侧（避开膀胱和血管）用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm后，再以45°
角刺穿腹部肌肉而进入腹腔（刺穿腹肌时有一落空感）。
针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。
注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。
二、常用手术器械及操作方法：
1．解剖针：
用于挑、刺等。
常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。
2．解剖刀（即外科手术刀）：
用于各种皮肤切口和组织切除等。
持法有执弓法与执笔法两种。
前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；
后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。
3．大剪刀：
用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。
持法如图。
4．眼科剪刀：
用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。
5．眼科镊子：
用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。
6．钝头镊子：
用于提取脏器、组织等。
7．有钩镊子：
用于提取皮肤切口等。
常用手术器械
执手术刀的姿势
执手术剪的姿势
执手术镊的姿势
执手术刀、手术剪、手术镊的姿势
（张之曾编）
细胞生物学实验绘图方法与要求
一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确（注意各部结构的比例关系）。
二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。
三、各部结构名称要在一侧引直线注明。
各引线要平行不得交叉。
四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。
实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量
【实验目的】
制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。
【实验用品】
一、材料和标本蟾蜍一只，人血液一滴。
二、器材和仪器配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一个、牙签。
三、试剂1％甲苯胺兰、1％甲基兰、Ringer氏液（两栖类用）。
【实验内容】
一、细胞的基本形态观察
（一）原理
细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。
例如：
具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；
具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；
游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。
不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：
细胞膜、细胞质和细胞核。
但也有例外。
哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。
（二）观察方法与结果
1．制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。
取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。
将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。
将上面的载片取下即可得到压片。
在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液。
在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。
染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁（参照照片）。
2．蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察
剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维（肌细胞）。
尽可能拉直肌纤维。
在显微镜下观察，肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边（参照照片）。
3．蟾蜍肝脏压片的制备与观察
剪开蟾蜍腹腔，取一小块（约2～3mm3）肝放在平皿内，用Ringer氏液洗净，用镊子轻压将肝中的血挤出。
然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。
染色用甲基兰。
显微镜下观察可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形（参照照片）。
4．蟾蜍血涂片的制备与观察
取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上．将另一载片的一端呈45°
角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。
（图l一1）。
晾干。
显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。
白细胞数目少，为圆形。
图1—1血涂片的制备
5．人血涂片的制备与观察
取人血一滴，制片方法同上。
显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。
自细胞数目少，为圆形。
6．人口腔上皮细胞标本的制备与观察
用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上（不可反复涂沫），滴一滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。
显微镜下观察可见复盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。
二、测微尺的使用
测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。
目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。
圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。
因此，用前必须测定。
镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长1毫米（1000μm），被分为100格，每格长度是10微米。
（二）方法
1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数（图1—2）。
2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度
目镜测微尺每格代表的长度（μm）=
X10
三、测量人口腔上皮细胞
从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。
【作业】
一、分别求出使用低倍镜（10X），高倍镜（40X）时目镜测微尺每格代表的长度：
低倍镜：
目镜测微尺每格代表的长度=XlO（μm）=μm
高倍镜：
二、分别绘制所观察的6种细胞并注明基本结构。
三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。
计算细胞、细胞核体积的公式：
圆形V=4/3πr3（r为半径）
椭圆形V=4/3πab2（a、b为长、短半径）
核质比N／D=Vn／（Vc—Vn）（Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积）
实验二线粒体（Mitochondrion）的活体染色及电镜照片观察
掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。
一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。
二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml注射器、吸管。
三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液（哺乳类用）。
一、兔肝细胞线粒体的活体染色
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿B是线垃体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液（用镊子轻压），用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。
当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。
染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。
将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。
（三）结果
显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。
二、线粒体的光镜切片观察
用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。
三．线粒体的电镜照片观察
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。
线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。
线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。
一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。
脊的横切面呈囊状或管状。
脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。
这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：
第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。
第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。
可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。
第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。
绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。
（时伟红编）
实验三液泡系（Vacuolarsystem）的活体染色
及电镜照片观察
掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的基本形态结构。
一、材料和标本蟾蜍一只，软骨细胞电镜照片。
二、器材和仪器光学显微镜一台、手术器材一套、解剖盘一个、载片、盖片、吸水纸。
三、试剂l／3000中性红染液、Ringer氏液（两栖类用）。
一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察
在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。
软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。
取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上，滴两滴1／3000中性红染液，染色8～lO分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余Ringer氏液。
显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色．大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。
二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察
动物细胞液泡很小，即使是活体染色也只能看出是一个小点，为了进一步看清液泡的结构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。
大白鼠胫骺骨细胞电镜照片，细胞核与核仁很清楚，细胞质中有丰富的粗面内质网，液泡系发达，液泡由单层膜包围，细胞周边有液泡释放。
绘制光镜下软骨细胞液泡系。
（时伟红编）
实验四细胞中的微丝染色及微丝
与细胞形态的实验观察
掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。
一、材料和标本盖片培养的成纤维细胞三片。
二、器材和仪器光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。
三、试剂PBS（pH7.2）、2％TritonX—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。
一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应
（一）原理
微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。
细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。
（二）细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察
1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。
2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B4滴继续培养半小时。
3.将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。
两小时后细胞形状恢复，接近正常。
4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。
5．染色处理
①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。
②将盖片移入2％TritonX一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。
③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。
M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。
⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。
然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。
光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。
在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；
用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；
用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。
二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应
（一）原理
丽藻细胞大，整个细胞的中央为大液泡占据。
靠近液泡是一层溶胶样流动的内质，在内质与质膜之间，为静止的外质，其中含有叶绿体。
内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞质环流。
在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。
成束的微丝出现在外质与内质接口（溶胶和凝胶接口）并交织一起，与环流方向平行。
用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。
1．剪下一小块丽藻叶片（1～2cm），置于载片上，盖上盖片。
2．观察（阳光充足时效果较好）。
3．再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B，10~15分钟后盖上盖片，观察。
4．洗去药物，再观察。
在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。
三、微丝的电镜照片观察
恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径5～8cm，它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。
绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。
实验五细胞器的光镜切片
和电镜照片观察
观察除了实验二～五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的基本形态结构。
一、三种细胞器的光镜切片
（一）高尔基复合体（GolgiComplex）
用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:
神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有发达的内质网和高尔基复合体，在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。
神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。
转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。
在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规则的条索状结构即为高尔基复合体。
图5一l神经节细胞（示高尔基复合体）
（二）尼氏小体（Nissl’sBody）
甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。
在低倍镜卡观察，染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶质细胞。
转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。
图5—2脊髓前角神经细胞的尼氏小体
（三）中心体（Centrosome）
铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。
在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒——中心粒，它与周围致密的细胞质——中心球，组成中心体。
转换高倍镜观察，可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。
染色体中心体
图5—3马蛔虫受精卵细胞、分裂中期（示中心体）
二、六种细胞器的电镜照片
（一）高尔基复合体（GolgiComplex）
人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：
细胞质中有散在的高尔基复合体，其结构要由三部分组成：
扁平囊、
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