高中生物第1部分微生物的利用实验1大肠杆菌的培养和分离教案浙科版Word格式文档下载.docx

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除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；

取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；

最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

（2）涂布分离法：

先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。

通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。

将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。

细菌的两种分离法各有优点，都可采用。

划线分离法，方法简单；

涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。

四、灭菌操作

1．各种器皿必须是无菌的：

实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌（1kg/cm2压力、121℃、15min）处理，并在超净台上使用。

注意：

实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。

2．各种培养基必须是无菌的。

3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。

培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。

五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤

1．在两个250mL三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基，加上封口膜。

将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15min。

2．灭菌后待培养基冷却至60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。

在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。

为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？

【提示】　酒精灯火焰旁约10cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。

3．扩大培养

先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37℃每分钟200转的摇床上振荡培养12h。

4．划线分离

用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37℃，恒温培养箱中培养12～24h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

5.在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。

微生物培养的基本条件

1.培养基及其类型

（1）培养基：

①概念：

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。

②作用：

在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。

（2）培养基的种类

划分标准

培养基种类

特点

用途

物理性质

液体培养基

不加凝固剂

微生物的扩大培养、工业生产

半固体培养基

加凝固剂，如琼脂

观察微生物的运动、分类鉴定

固体培养基

微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

选择培养基

培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

培养、分离出特定微生物（如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；

培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐）

鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽）

2.无菌技术

进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：

（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

3．消毒和灭菌的比较

概念

常用方法

应用的范围

消毒

使用较为温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）

煮沸消毒法：

在100℃开水中煮沸5～6min

一般物品

巴氏消毒法：

70～75℃煮30min或在80℃煮15min

对于一些不耐高温的液体，如牛奶

化学药剂消毒法

如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等

灭菌

使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）

灼烧灭菌：

酒精灯火焰

接种工具的灭菌

干热灭菌：

干热灭菌箱内160～170℃下灭菌1～2h

玻璃器皿、金属工具的灭菌

高压蒸汽灭菌：

121℃条件下，灭菌15～30min

培养基及容器的灭菌

注：

消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活

　某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。

实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。

请回答与此实验相关的问题。

（1）制备培养基：

根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。

对细菌进行大量的扩增，用________培养基进行培养；

对细菌进行分离，用________培养基进行培养。

（2）灭菌：

在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种________都必须是无菌的。

对它们进行灭菌，通常用________法灭菌。

（3）接种及培养：

接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。

为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37℃。

要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。

（4）菌落观察计数：

培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。

一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。

（5）选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。

如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌。

【思路点拨】　

（1）细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。

（2）无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。

实验室中常用高压蒸汽灭菌法。

（3）接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。

在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。

（4）不同的菌落具有各自不同的菌落特征（如硬度、颜色、透明度、光滑度等。

）（5）选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

【答案】　

（1）液体　固体平面　

（2）器皿和培养基高压蒸汽灭菌　（3）接种环　恒温培养箱　无菌水（4）多　高　（5）盐（或NaCl）

1．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（　　）

A．接种环、手、培养基B．高压锅、手、接种环

C．培养基、手、接种环D．接种环、手、高压锅

【解析】　此题考查对无菌技术的掌握。

高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。

用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。

火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。

【答案】　C

大肠杆菌的培养和分离

1.LB培养基的制备

（1）计算：

根据LB培养基配方的比例，计算配制50mL的培养基时各种成分的用量。

（2）称量：

准确地称取各种成分。

即：

蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g，加水50mL。

（如配LB固体培养基，则再加1g琼脂）

（3）制备空白斜面：

将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。

灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。

2．进行大肠杆菌培养与分离操作

（1）灭菌

（2）制备LB固体平面培养基——倒平板操作

待培养基冷却至60℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

倒平板的具体操作描述如下：

（3）扩大培养

①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。

②将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。

③将菌体放入三角瓶液体培养基中（将封口膜及斜面棉塞复原）。

④三角瓶在37℃摇床振荡培养12h。

（4）划线分离

①取种

在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。

②平板划线操作

在LB固体培养基的平板上连续划线（如下图所示），划线后盖好培养皿。

③培养

将上述划线操作后的培养皿倒置放至37℃恒温培养箱中培养12～24h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

（5）菌种纯化与保藏

在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37℃培养24h后，4℃冰箱保存即可。

划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体（菌落），从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。

　下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程：

→

请回答：

（1）灭菌常用________法，灭菌后，要待________________时才能打开锅盖。

（2）倒平板和接种前要用________擦手。

接种和划线前使用________的方法对接种环灭菌。

（3）划线分离时，接种环在菌液中蘸取________次。

下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在乙图中画出第三次划线。

（4）划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是__________________。

（5）实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？

____________________。

【思路点拨】　此题考查大肠杆菌的培养和分离过程，具体分析如下：

（1）灭菌是指对LB液体培养基和LB固体培养基进行的灭菌。

对培养基进行的灭菌应该是用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。

灭菌后，灭菌锅内的压力与大气压相同时，才能打开灭菌锅，否则会造成培养液溅出。

（2）在进行实验操作时，操作者的双手要用酒精棉球擦拭消毒，接种环要用火焰烧灼灭菌。

（3）划线分离时，接种环在菌液中蘸取菌液1次然后连续划线。

（4）在培养时，培养皿须倒置，目的是防止冷凝后形成的水滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。

（5）实验完成后，接触过细菌的器皿应灭菌处理以防止污染。

【答案】　

（1）高压蒸汽　灭菌锅内压力与大气压相同

（2）酒精棉球　（酒精灯火焰上）灼烧

（3）1　（见右图）

（4）避免水滴污染培养基

（5）接触过细菌的器皿应作灭菌处理

划线分离操作

①第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：

第一次灼烧

每次划线之前灼烧

划线结束灼烧

目的

避免接种环上可能存在的微生物污染培养物

杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端

杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者

②灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

③划线时最后一区域不要与第一区域相连。

④划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。

2．下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答：

（1）A过程配制的是通用细菌培养基，称为________培养基。

配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持________。

对培养基酸碱度的调节，应该在B过程的________（填“前面”或“后面”）。

（2）D过程与C过程相比，培养基中增加的物质是________。

E过程所需的温度是________。

（3）D过程后，一个菌体便会形成一个________，这种分离方法是________________的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。

【答案】　

（1）LB　渗透压　前面　

（2）琼脂　4℃

（3）（单）菌落　消除污染杂菌（纯化菌种）

1．下列有关倒平板操作错误的是（　　）

A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上

B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰

C．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上

D．等待平板冷却凝固后需要将平板倒过来放置

【解析】　整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵，因此，灭过菌的培养皿放在火焰旁，打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰，培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能将培养皿盖完全打开，等待平板冷却凝固后需要将平板倒过来放置。

2．无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是（　　）

A．对培养操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌

B．对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌

C．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行

D．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触

【解析】　灭菌是采用强烈的理化因素对用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基进行处理，使物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子都要被杀死；

实验操作者的衣着和手以及操作空间只能进行消毒。

【答案】　A

3．下列依次表示倒平板、接种的位置，以及划线法接种的路径示意图，其中错误的是（　　）

【解析】　在划线时，应在第一区的划线末端开始往第二区域内划线，在第二区的划线末端开始往第三区划线。

【答案】　D

4．关于大肠杆菌的培养和分离实验以下叙述不正确的是（　　）

A．本实验的内容是将大肠杆菌进行扩大培养和划线分离

B．本实验用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，再在LB固体平面培养基上划线进行大肠杆菌的分离

C．除划线分离外，也可用涂布分离法分离大肠杆菌，两种分离方法中划线分离方法简单且单菌落更易分开

D．进行培养之前对加入培养基的三角瓶、试管也要在121℃下灭菌15min

【解析】　划线分离与涂布分离均可实现对大肠杆菌的分离，其中划线分离法操作简单，但单菌落相对不易分开，涂布分离法操作虽相对复杂，但单菌落更易分开。

5．微生物与人类关系密切。

虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。

（1）培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供____________。

对培养基进行灭菌，应该采用的方法是____________。

接种时通常采用________法。

（2）在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，要将平板倒置的原因是____________________________________________________

____________________________________________________________。

（3）微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和____________法。

在用平板划线法接种时，在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的目的是______________________________________________________________

______________________________________________________________

在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？

为什么？

【答案】　

（1）氮源（碳源）、碳源　高压蒸汽灭菌　平板划线

（2）皿盖上会凝有水珠，防止水珠落入培养皿造成污染，还可使培养基表面的水分更好地挥发

（3）稀释涂布平板

第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基。

每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落　划线结束后仍要灼烧接种环，以免菌种对环境造成污染和感染操作者

学业达标测评

（一）　大肠杆菌的培养和分离

1．要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（　　）

A．固体培养基

B．液体培养基

C．加青霉素的培养基

D．加入高浓度食盐的培养基

【解析】　分离微生物应使用固体培养基。

2．涂布平板操作需要用到（　　）

A．接种环、滴管、酒精灯

B．接种环、移液管、酒精灯

C．涂布器、移液管、酒精灯

D．涂布器、接种环、酒精灯

【解析】　涂布平板操作过程中不需要接种环。

3．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌（　　）

A．接种环、吸管、培养基、接种室

B．吸管、接种环、培养基、接种箱

C．培养基、接种环、吸管、接种箱

D．培养皿、吸管、培养基、双手

【解析】　干热灭菌主要对玻璃器皿进行灭菌，紫外线主要对接种室和接种箱进行空气和表面灭菌。

【答案】　B

4．下列操作错误的是（　　）

A．用酒精擦拭双手

B．用氯气消毒水源

C．实验室用紫外线进行消毒

D．玻璃器皿（吸管、培养皿）用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的

【解析】　玻璃器皿应用干热无菌箱在160～170℃加热1～2h才能达到无菌目的。

5．在涂布平板操作时错误的是（　　）

A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红

B．取少量菌液滴加在培养基表面

C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却8～10s再用

D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀

【解析】　涂布平板所用涂布器是玻璃器皿，不能在酒精灯火焰上灼烧，否则会变形，正确方法是沾取少量酒精，引燃。

6．利用涂布分离法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是（　　）

A．培养基制备过程中被杂菌污染

B．接种过程中，无菌操作不符合要求

C．系列稀释时，无菌操作不符合要求

D．由大肠杆菌的种类不同造成的

【解析】　大肠杆菌培养基中出现了多种菌落，说明污染了杂菌，杂菌可能来自培养基，也可能是因为操作过程中无菌操作不符合要求。

7．下列与大肠杆菌及其培养与分离的相关叙述正确的是（　　）

A．大肠杆菌是革兰氏阳性菌

B．大肠杆菌的代谢类型是异养需氧型

C．可用LB固体平面培养基扩大培养大肠杆菌

D．进行平板划线分离时，接种环只需蘸菌液一次

【解析】　大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其代谢类型为异养兼性厌氧型，扩大培养大肠杆菌宜使用LB液体培养基，LB固体平面培养基可用于划线分离，进行划线分离时，为达到分离目的，获得单菌落，接种环只需蘸取菌液一次，故只有D选项所述正确。

8．（2016·

杭州检测）请回答微生物培养的有关问题：

（1）人们按照微生物对营养物质的不同需要，配制出供其生长繁殖的营养物质称培养基。

培养基之所以有________、________和半固体培养基等三种，主要是培养基中所添加的________含量不同。

（2）微生物个体是肉眼看不见的，但固体培养基上的微生物的________是可见的，该结构的特征常常是鉴定菌种的主要依据之一。

（3）微生物的营养包括碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。

培养乳酸杆菌时，在培养基中所添加的维生素属于________；

在培养基中添加酸或碱或缓冲溶液的作用是__________________________________________________。

（4）培养微生物的操作必须实行无菌操作，以防止____________的入侵等作用。

无菌操作主要包括________和灭菌；

前者不能杀死芽孢和孢子，后者能杀死芽孢和孢子。

（5）微生物接种的方法很多，最常用的是________和______________。

【答案】　

（1）固体培养基　液体培养基　琼脂（凝固剂）

（2）菌落

（3）生长因子　调节培养基的pH（酸碱度）

（4）外来杂菌　消毒

（5）平板划线法　稀释涂布平板法

9．从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：

采集菌样→富集培养→纯种分离