基因操作技术分章节作业题Word格式文档下载.docx

基因操作技术分章节作业题Word格式文档下载.docx

《基因操作技术分章节作业题Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因操作技术分章节作业题Word格式文档下载.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。

包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）两类。

分类：

DNA脱氧核糖核酸RNA（t/r/m）核糖核酸

结构：

核苷酸→磷酸，核苷（戊糖\碱基）

DNA二级结构——双螺旋结构

DNA三级结构——超螺旋结构

DNA的四级结构——DNA与蛋白质形成复合物

RNA:

核糖体RNA（rRNA）信使RNA（mRNA）转运RNA（tRNA）

2.核酸有哪些重要的理化性质？

这些性质在基因操作中有什么作用？

理化性质:

1.两性解离（电泳）2.紫外吸收（核酸质量检测,260nm）3.沉降特性（分离核酸,测定核算的沉降常数）4.DNA的变性,复性与分子杂交（PCR）

3.比较病毒基因组、原核生物基因组、真核生物基因组的特点。

病毒基因组:

1.基因组可由DNA组成,也可以由RNA组成,但是只能是由其中一种组成,大多数为单倍体2.基因组小,基因数目少,重复序列少.大部分用来编码蛋白质3.存在重叠基因4.噬菌体基因无内含子,结构连续,病毒中含有内含子,结构间断5.基因组内存在操纵子结构

原核生物基因组:

1.具有类核结构,基因组多数由环状双链DNA分子组成2.基因绝大部分是用来编码蛋白质的,蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在,一般来说蛋白质编码是连续的3.功能相关的基因大多数以操纵子结构出现4.编码RNA的基因通常是多拷贝的5.结构基因中一般无重叠现

真核生物基因组:

1.真核生物基因组庞大,具有染色体结构,存在着丝粒和端粒这两个特殊的DNA序列2.基因组存在着大量的重复序列3.大部分为非编码序列,占基因组序列的90%以上4.绝大多数结构基因为断裂基因,有内含子结构,转录产物为单顺反子5.存在大量的顺式作用元件,包括启动子,增强子,沉默子6.存在大量的DNA多态性（序列变异导致差异）

4.简述DNA复制、RNA转录以及蛋白质翻译的过程及其参与的酶和蛋白因子的作用。

DNA复制:

起始→延伸（5’→3’）→终止;

1.DNA聚合酶碱基（作用于互补不配对）2.DNA连接酶（催化形成磷酸二酯键）3.引物酶和引发体（作为DNA复制前的基础,没有引物的基础DNA无法进行聚合反应;

引物酶与另外几种辅助蛋白质组装成引发体,才有合成引物的活性）4.解链酶（催化解开双链,提供单链DNA模板）5.拓扑异构酶（消除DNA超螺旋）6.单链结合蛋白（保护单链DNA免遭核酸酶的讲解,防止再度形双螺旋）

RNA转录:

起始→延伸（5’→3’）→终止;

RNA聚合酶（（催化RNA合成的酶）

蛋白质翻译:

5.以大肠杆菌乳糖操纵子为例说明原核生物基因表达调控的特点。

大肠杆菌乳糖操纵子含Z,Y,及A三个结构基因,分别编码β—半乳糖苷酶,通透酶.乙酰转移酶,此外还有一个操纵序列O,一个启动序列P及一个调节基因I。

1.阻遏蛋白的负调控2.CAP正调控（书25页）

项目2

一、名词解释

基因工程:

是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术

基因操作技术:

在分子水平上，采取工程建设方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去，使后者定向获得新遗传性状的一门技术。

基因克隆:

:

经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。

通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成

基因文库:

指某一生物类型全部基因的集合

二、问答题

1.基因操作的基本步骤是怎样的？

每一步骤各需要哪些物质参与？

（1）目的基因的克隆，即从供体生物的基因组中分离或人工合成带有目的基因的片段。

（质粒DNA提取试剂盒、无水乙醇、buffer、核酸染料、无菌离子水）

（2）在体外通过限制性内切酶分别将分离（或合成）得到的目的DNA偏度昂和载体分子进行定点切割。

使之片段化或线性化。

（buffer、限制性核酸内切酶EcoPI）（3）在体外通过DNA连接酶将含有目的基因的DNA片段与载体分子相连，构建重组DNA分子。

（4）将重组DNA分子通过一定的方法引入到受体细胞进行扩增和表达，从培养细胞中或得大量细胞繁殖群体。

（LB液体培养基、CaCl2）（5）筛选和鉴定转化细胞，提出非必需重组体，或得目的基因稳定高效表达的基因工程菌或细胞，即将所需要的阳性克隆挑选出来。

（6）进一步分析研究选出细胞克隆的基因，并设法实现功能蛋白的表达。

2.目的基因克隆的方法有哪些？

1.根据蛋白质序列克隆母的基因

2.根据基因表达差异（mRNA）克隆基因

项目3

质粒:

质粒是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA,存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，也可丢失及在细菌之间转移

电泳:

带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳

1.简述提取核酸的基本步骤。

I.材料准备→II.破碎细胞或包膜，释放内容物→III.核酸分离、纯化→IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质→ 

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中

2.简述提取质粒DNA的经典方法的步骤及原理。

（碱裂解法）

1.取3ml菌液于Eppendorf管中，10000r/min，离心1min，

2.去上清,倒扣在滤纸片上西区残液,向菌体沉淀中加入100l（葡萄糖+EDTA+溶菌酶）溶液Ⅰ（事先加入RNaseA----全部加入，混匀）

3.吹散菌体,冰上放置5min

4.加入200l溶液Ⅱ（NaOH+SDS），温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解（不要超过5min）；

冰上放置5min

5.加入150l溶液Ⅲ（KAcpH=9.8），立即温和地上下翻转6-8次，冰上放置5min

6.4°

C,12000r/min，离心5min

7.吸上清约400l至另一离心管

8.加两倍体积800l预冷的无水乙醇,混匀,冰上放置5min

9.4°

10.弃上清,加800l70%的乙醇漂洗一次（去盐）

11.弃上清,将离心管倒置于滤纸上,除尽乙醇,自然风干

12加入20lTE缓冲液,溶解质粒DNA

13.放入离心管盒,-20°

C保存备用

3.简述提取基因组DNA的经典方法的步骤及原理。

原理:

由于染色体DNA较长，易断裂，因此要避免太过剧烈的机械刺激

1.培养细菌，离心，弃上清

2.加入10%SDS和蛋白酶K，混匀，37℃温育1h（溶解细菌、消化蛋白质，如为G+菌还应加入溶菌酶）

3.加入CTAB-NaCl溶液，65℃温育20min（选择性沉淀和去除细胞壁碎片、多糖和残余的蛋白）

4.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,混匀，离心（去除CTAB的蛋白-多糖复合物，使蛋白质变性、分离，DNA因为不溶于有机相而留在水相中）

5.取上清，再加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，离心5min（DNA仍留在水相中）

6.取上清，加入1倍体积的异丙醇（沉淀DNA）

7.用70%的乙醇洗涤沉淀（洗去盐、CTAB等），离心，弃上清,务必要晾干DNA

8.沉淀用TE（ddH2O）溶解，备用

4.结合实验比较经典碱裂解法与试剂盒法提取质粒DNA的差异。

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。

碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

碱裂解法也有缺陷,容易导致不可逆的变性,不适合大质粒的抽提取,如果加入试剂盒就能很好的解决这个问题,所以大多数的试剂盒用得就是碱裂解法。

5.结合实训简述试剂盒法所加试剂的作用？

溶液Ⅰ：

除去RNA

溶液Ⅱ：

裂解细胞

溶液Ⅲ：

沉淀DNA

TE缓冲液：

溶解DNA

6.简述测定核酸浓度和纯度的方法原理及步骤

紫外分光光度法:

原理→分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸收度,对该物质进行定性和定量分析。

（书60页）

凝胶电泳法:

原理→又称胶体电泳，是一大类技术，被科学工作者用于分离物理性质（如大小,形状,等电点等）不同的分子。

（书61页）

7．简述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理、操作步骤、影响因素

DNA分子在碱性环境中带负电荷（磷酸基团），外加电场作用下向正极泳动；

不同的DNA分子，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带；

操作步骤:

1.制胶→称一定量的琼脂糖，加入电泳缓冲液，加热溶解；

准备制胶模具，加梳子；

倒胶，胶厚一般为0.3-0.5cm；

冷却凝固，取出梳子，凝胶置于电泳槽中2.加缓冲液→加入电泳缓冲液，液面高于胶面1mm3.点样→DNA样品与载样缓冲液混匀；

吸取混合液，加入样品孔中。

4.电泳→设置好电压，接通电源；

根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳；

切断电源，取出凝胶，观察结果。

影响因素:

1.DNA分子大小2.DNA分子构型3.不同的胶浓度4.电场强度5.溴化乙锭（EB）5.电泳缓冲液

8.结合DNA琼脂糖凝胶电泳实训简述所用试剂的作用。

载样缓冲液待电泳的样品在点样前与之相混合的一种缓冲液。

作用：

增加样品密度保证DNA沉入加样孔内;

使样品带有颜色易于点样,其中的染料在电场中以可预测的泳动速率向阳极迁移，可参考来判断DNA的电泳情况

电泳缓冲液作用:

在电泳过程中维持合适的pH；

使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移；

核酸染料作用:

对核酸进行染色，使通过紫外光进行直接（肉眼）或间接（凝胶成像仪）观察到DNA.

9.简述SDS-PAGE电泳分离蛋白质的原理及操作步骤

原理：

蛋白样品同十二烷基硫酸钠（SDS,有毒,要小心）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性肽链被打开后与SDS结合而带负电荷电泳时在电场作用下，向正极迁移，由于分子量和受阻力不同而分离

:

1.制胶→两块玻璃板洗干净，轻拿轻放；

两板之间要加分隔片夹板时均匀用力;

固定夹板，底部封口2.加样→品与等量2×

SDS上样缓冲液混合，100℃加热3-5min；

离心，取上清，点样3.电泳→插上电极，接通电源；

开始时小电流，待样品进入分离胶后再加大电流，待电泳完毕后关闭电源4.染色→考马斯亮蓝;

二甲花青亮蓝;

银染色5.脱色、检测

项目4

PCR:

聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期

变性:

在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性（denaturation）。

变性温度:

加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度

退火:

DNA由单链复性、变成双链组织的进程

退火温度:

退火温度为引物和模板结合时候的温度参数，它是影响PCR特异性的较重要因素

延伸:

核酸等的生物合成过程中逐个添加核苷酸的过程

延伸温度:

延伸温度就是酶的最适温度

载体:

将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子

质粒载体:

在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程

λ噬菌体载体:

构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除，按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：

一种是插入型载体，只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，另一种是替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两位点之间的人DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。

病毒载体:

是一种常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制

克隆载体:

通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。

将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖

表达载体:

就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件），使目的基因能够表达的载体

多克隆位点（MCS）限制性内切酶:

回文结构:

双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称为回文结构，每条单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的

1.简述PCR反应的基本原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

2.简述PCR反应体系的组成和体系中各成分的作用

反应体系组成

◆4种dNTP混合物各200mol/L

◆引物　　　　　各10～100pmol

◆模板DNA　　　0.1～2g

◆TaqDNA聚合酶2.5u

◆Mg2+　　　　　1.5mmol/L

各成分的作用1.模板：

模板是待扩增的核酸；

2.引物浓度：

引物是与靶DNA特异性结合的寡核苷酸片段；

3.dNTP：

提高反应产量4.Mg2+：

对TaqDNA聚合酶的影响很大5.缓冲液：

维持PCR反应体系的pH;

3.简述PCR的标准反应过程设定那些参数？

其中那个参数最为重要，需要在实际工作中优化。

参数:

1.变性温度与时间（高温酶失活，温度不够93°

C不能完全变性）2.退火温度与时间（55°

C,30s~60s）3.延伸温度与时间（70°

C~75°

C,,1min）4.循环次数（25~40次）

最重要:

变性,导致PCR失败的最主要原因。

4.简述PCR引物设计的原则。

1.引物序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列；

2.引物长度以15-30bp为宜，一般为20-27bp;

3.GC含量一般为40-60%,若GC含量低，要适当降低PCR时的退火温度，但会影响扩增的特异性；

4.碱基尽可能随机分布，尤其是3‘端避免出现GGG或CCC，容易发生错配；

5.引物自身不能有连续4个碱基互补，避免内部形成发夹结构；

6.两条引物间也应避免有互补序列，避免形成引物二聚体；

7.引物3’-OH端为延伸起始端，不能进行任何修饰，也不能终止于密码子第3位；

8.引物5’端可以修饰，如加上酶切位点、荧光标记等。

5.简述载体的概念、种类。

概念：

能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。

三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

种类克隆载体:

克隆一个基因或DNA片断;

用于一个基因的蛋白表达整合;

穿梭载体：

既可在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达

6.简述作为载体应具备的条件。

1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。

2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。

3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。

4、有适合的标记，易于选择。

5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。

6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。

7.简述表达载体应该具备的条件

表达载体：

按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

条件:

具有克隆载体元件,启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。

8.简述噬菌体载体的特点及其类型

特点：

将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。

类型：

1.插入式载体（一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。

）2.替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代3.凯伦噬菌体载体

9.以PBR322、PUC等载体为例，指出载体上应包括那些结构，各有何作用？

pBR322：

为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）

pUC：

1.来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2.氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3.大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4.位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。

但它并不破坏该基因的功能。

10.比较克隆载体与表达载体的异同。

克隆载体一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,在导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达但一定被大量复制而表达载体是一些用于工程生产的细菌,他们被导入目标基因,这些目标基因会在此类细菌中得到表达生产出我们需要的产物,导入的基因是有克隆载体产出的。

表达载体是按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

12.现在有一质粒载体大小为4200bp，在560处、1800处有两个EcoRI酶切位点，在2300处有1个BamHI酶切位点，在3100处有一个HindIII酶切位点。

试问，用各个酶进行分别进行单酶切时，各会得到几条片段，大小分别为多少？

若两两酶进行双酶切时，又分别会得到几条片段，大小分别为多少？

项目5

黏性末端:

II型限制酶在限制性片段上留下的单链末端，可与对应的单链末端互补结合

平末端:

当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。

转化:

是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象

转导:

由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。

它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。

其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中

转染:

采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染

重组子:

两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位

感受态细胞:

理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态

宿主细胞:

受体细胞也叫宿主细胞。

受体细胞有原核受体细胞）、真核受体细胞、动物细胞和昆虫细胞

1.简述连接酶的概念和常用类型

连接酶：

催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP）的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等。

常用类型T4噬菌体DNA连接酶：

以ATP作为能量来源。

大肠杆菌DNA连接酶：

以NAD+作为能量来源。

2.简述连接反应的影响因素

1.DNA末端特性：

为提高目的片段插入效率，避免载体发生自身环化，方法有：

碱性磷酸酶处理；

同聚勿加尾；

用柯斯质粒；

2.载体DNA和目的DNA之间比例摩尔比为1：

33.反应温度4.离子浓度

3.简述DNA重组技术的基本步骤

目的基因的获取→载体的选择和构建→DNA导入受体菌→外源基因与载体的连接→重组体的筛选→克隆基因的表达

4.基因转移的方法主要有哪些？

物理方法：

显微镜注射法、裸DNA直接注射、微粒轰击、电穿孔、显微注射

化学方法1.钙盐转化法：

氯化钙转化法（原核表达体系采用）磷酸钙共沉淀法（真核表达体系采用）2.磷酸钙共沉淀法3.DEAE—葡聚糖转染法4.脂质体转染法

生物学方法：

细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、颗粒轰击技术

5.结合实训简述氯化钙转化法的操作步骤和注意事项有哪些？

步骤：

（一）感受态细胞的制备受体菌的培养1.取适量4℃离心10分钟2.弃上清,用冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬菌体，冰浴后4℃离心3.弃上清,加冷CaCl2二次重悬,冰浴,即为感受态细胞悬液，贮存于-70℃可保存半年。

（二）转化1.取感受态细胞悬液置冰上，加入DNA摇匀,冰上置30分钟，42℃水浴中热击2min，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟2.加入预热液体培养基,混匀，37℃振荡培养1小时左右，取适量涂布于含选择性抗生素的筛选平板适温培养3.对照：

取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（含筛选抗生素）和空白平板

注意事项1.用于制备感受态的细胞要保证:

较好的生长状态;

适宜密度，过高或不足均会影响转化效率2.用于转化的质粒要求:

质量（主要是超螺旋DNA;

浓度）；

与转化效率在一定范围内成正比（DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

）4.试剂的质量:

所用的试剂均需是最高纯度，用超纯水配制,分装保存于干燥的冷暗处。

5.防止杂菌和杂DNA的污染：

整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿是新的,并经高压灭菌处理,且注意防止污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

6.简述筛选重组子的方法有哪些？

举例说明抗药性筛选、营养缺陷型筛选、插入失活筛选、蓝白斑的筛选的原理。

方法：

1.根据载体遗传标记检测2.根据克隆DNA序列检测3.根据外源基因表达产物检测

抗药性筛选:

载体分子上携带某种抗生素的抗性基因,而受体细胞本身对这种抗生素敏感,将转化细胞涂布在加入这种抗