DNA复制引物酶及蛋白质Word格式文档下载.docx
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2.单链结合蛋白（singlestrandbindingproteins,SSBP）
ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。
原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：
若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；
真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。
ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。
所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。
ssbDNA蛋白稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。
它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用（图）。
SSBP与DNA单链结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。
在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲和力。
它们与DNA结合时有协同作用。
图 大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图
3、DNA旋转酶（DNAgyrase）是一个由两个GraA和两个GraB亚基构成的四聚体蛋白，DNA旋转酶以其可以利用ATP结合和水解的能量来介导负超螺旋到松弛的共价闭合DNA而闻名于所有拓扑异构酶。
它是DNA拓扑异构酶Ⅱ中的一种亚类，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA复制中起十分重要的作用。
迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶。
作用机理：
DNA复制时解链产生正螺旋，阻碍复制体的前进，DNA旋转酶通过引起瞬间DNA双链的断裂和重新连接，以改变DNA的拓扑状态，引入负超螺旋。
4.引发体的形成：
DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。
由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。
大肠杆菌的引发前体由DnaB.DnaC和单链结合蛋白组成。
（1）引物酶（primase）
它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。
这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。
RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。
催化RNA引物合成的酶叫引发酶（primerase）。
引发酶识别DNA单链模板特异序列，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸，产生3′-OH，为DNA聚合酶起始磷酸二酯键提供条件。
引物与典型的RNA不同，他们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。
实验表明，在细菌中，前导链的引物和滞后链中前体片断的引物在合成时需要不同的条件。
滞后链前体片断引物的合成是由引发酶催化的，而引发酶对利福平（rifampicin）不敏感，因此不受利福平抑制；
前导链引物的合成是由RNA聚合酶催化的，而RNA聚合酶对利福平十分敏感，所以受利福平强烈抑制。
（2）引发体（primosome）
高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。
5、DNA聚合酶
1）DNA聚合酶I
DNA聚合酶I最初由Kornberg于1955年在大肠杆菌中发现的，纯化的酶是一条相对分子量为109KD的多肽链。
用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。
较大的C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，常用做体外合成DNA的工具酶；
具有5′→3′的聚合酶活性，可以将脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3′-OH上，形成3′，5′-磷酸二酯键，这个活性需要DNA模板和引物的存在。
klenow片断还具有3′→5′的外切酶活性，可以从3′端将DNA链水解。
当正确的核苷三磷酸进入正在合成的链的末端，酶就向前移动，一旦发生错误，酶就退回，将错误的碱基切除，这是一种校对（proofreading）功能。
较小的N末端片断分子量为35KD，具有5′→3′的外切酶活性，在体内功能是切除小的DNA片断，包括切除RNA引物。
尽管DNA聚合酶I活性很高，但它们的主要功能是用于修复体内DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。
DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。
在DNA复制中，RNA引物的切除实际上就是切口平移；
DNA的损伤修复中也存在切口平移。
在体外，可以用切口平移来制备高放射性活性的DNA探针。
2）DNA聚合酶Ⅲ
DNA聚合酶Ⅲ全酶以异源复合体发挥功能。
α亚基、ε亚基和θ亚基相连组成核心酶（coreenzyme），每种亚基两个，形成两个催化合成DNA的活性中心。
α亚基具有5′→3′的聚合酶活性，并具有5′→3′的外切酶活性；
ε亚基具有3′→5′的外切酶活性，这对校正功能十分重要。
核心酶在τ亚基存在下，形成二聚体。
其他亚基的添加促进二聚化和增强了酶活性（τ亚基起着促使核心酶二聚化的作用）。
DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力，β亚基在二聚体形成中发挥重要的作用。
β亚基的功能犹如夹子、两个β亚基夹住DNA分子并可以向前滑动，使聚合酶在完成复制前不再脱离DNA，从而提高了酶的持续合成能力（通过它形成一个环使DNA聚合酶Ⅲ的核心酶附着在DNA模板上，并可以沿单链DNA滑动而使DNA的复制过程程序化）。
β亚基的定位能防止核心酶在DNA复制过程中从模板上掉下来，如果没有β亚基，核心酶只能合成大约20个核苷酸就要脱离模板。
除了β亚基以外，γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶，两个γ亚基与另4个亚基（δ亚基、δ′亚基、χ亚基、ψ亚基）构成γ复合物，其主要功能时帮助β亚基夹住DNA，故称夹子装置器（clamploader）。
β亚基在DNA上定位和解离都需要γ复合物介导。
完整全酶为不对称二聚体结构。
当聚合酶遇到逆向模板上前面合成的冈崎片断时，γ复合物的存在允许β亚基从模板上解离。
这样当核心酶合成了冈崎片断，将从后滞链的全酶中释放出来，与下一个由DNA引发酶提供的模板引物的起始前复合物结合。
在半不连续复制过程重，同一个DNA聚合酶Ⅲ分子可以同时合成前导链和滞后链。
更确切地讲，在前导链和滞后链的生长点，核苷酸的增加同时进行。
如前所述，DNA聚合酶Ⅲ有两个DNA合成催化中心，很可能前导链和滞后链各利用一个催化中心合成DNA。
滞后链的模板链围绕一个催化中心折叠成环状结构，使滞后链的方向颠倒（生化方向不变）。
6、DNA连接酶
DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的3′-OH与5′-P酰基形成磷酸酯键。
酶的活化?
NAD+或ATP中的腺苷酰基（AMP）与酶活性中心的赖氨酸残基的ε-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶-AMP；
腺苷酰化DNA?
酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。
亲核攻击完成DNA连接?
通过相邻DNA的3′-OH对活化的P原子进行亲核攻击，生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。
二、DNA复制过程
真核、原核的复制大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。
起始：
DNA解旋酶在局部展开双螺旋结构的DNA分子为单链，引物酶辨认起始位点，以解开的一段DNA为模板，按照5'
到3'
方向合成RNA短链。
形成RNA引物。
DNA片段的生成：
在引物提供了3'
-OH末端的基础上，DNA聚合酶催化DNA的两条链同时进行复制过程，由于复制过程只能由5'
->
3'
方向合成，因此一条链能够连续合成，另一条链分段合成，其中每一段短链成为冈崎片段（Okazakifragments）（由日本冈崎夫妇发现并命名）。
RNA引物的水解：
当DNA合成一定长度后，DNA聚合酶水解RNA引物，补填缺口。
DNA连接酶将DNA片段连接起来，形成完整的DNA分子。
最后DNA新合成的片段在旋转酶的帮助下重新形成螺旋状。
（一）DNA复制的引发
复制的引发（Priming）阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3'
-OH末端。
复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶（不是引物酶）沿滞后链模板转录一短的RNA分子。
在有些DNA复制中，（如质粒ColE），该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。
但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。
它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活（transcriptionalactivation），在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。
这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。
可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。
DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。
由复制因子X（n蛋白），复制因子Y（n'
蛋白），n"
蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体（preprimosome），在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。
引发前体进一步与引物酶（primase）组装成引发体（primosome）。
引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。
首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5'
→3'
方向不停的移动（这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后），在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。
但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。
由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。
而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置（序列）上才能合成RNA引物。
为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?
这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。
DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。
RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'
-OH端而进入DNA链的延伸阶段。
（二）DNA链的延伸
以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链（leadingstrand）；
另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链（laggingstrand）。
两条单链DNA复制的引发过程有所差异，但是不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA的合成。
因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5’—3’持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约2—3kb的冈崎片段。
DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。
这样就产生了一种拓扑学上的问题:
由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。
但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。
有两种机制可以防止这种现象发生:
[1]DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;
[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ（旋转酶）可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。
这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA链。
前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质（多肽）组成的聚合体，称为全酶。
全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。
α亚基具有聚合功能和5'
外切酶活性，ε亚基具有3'
→5'
外切酶活性。
另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。
在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。
如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。
这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。
当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。
这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。
通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多（最后只有一个冈崎片段的长度）。
而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。
按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体（replisome）。
复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。
在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。
当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5'
外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5'
合成DNA。
最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。
实验证明DNA的复制是由一个固定的起始点开始的。
一般把生物体的单个复制单位称为复制子。
一个复制子只含一个复制起点。
一般说，细菌，病毒即线粒体DNA分子均作为单个复制子完成其复制，真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制，即它们的基因组包括多个复制子。
多方面的实验结果表明，大多数生物内DNA的复制都是从固定的起始点以双向等速方式进行的。
复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起始点，向两个方向等速生长前进。
（三）DNA复制的终止
过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。
但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。
但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的?
已知DNA复制都要有RNA引物参与。
当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。
但是，在线性分子的两端以5'
为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。
在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。
T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。
而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。
T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'
端单链尾巴，两个子代DNA的3'
端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。
然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。
这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。
这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。
在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。
痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。
DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。
然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。
这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。
在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。
也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。
但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。
这种机制首先在四膜虫中发现。
该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5'
TTGGGG3'
序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。
这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。
这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。
在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。
环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样
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