人感染高致病性禽流感标本采集与实验室检测技术方案文档格式.docx
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件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。
3.1上呼吸道标本：
包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、
深咳痰液。
最佳采集时间为发病后3天内。
3.2
下呼吸道标本：
包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活
检标本。
3.3尸检标本：
病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生
物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允
许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
3.4
血清标本：
每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复
期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份
血清应在发病后第3～4周采集。
采集量要求5ml，以空腹血为佳，建议
使用真空采血管。
3.5
其它标本：
如果病例有腹泻症状，可在发病后采集粪便标本；
有胸水者可采集胸水标本。
4
标本采集方法
4.1咽拭子：
用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽
扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧
管盖。
4.2鼻拭子：
将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内
鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆
拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。
上述两根拭子浸入同一含3ml采
样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
4.3
鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：
用与负压泵相连的收集器从鼻
2
咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓
慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小
孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
4.4咽漱液：
用10ml不含抗菌素的采样液漱口。
漱口时让患者头
部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动。
然后将咽漱液收集于50ml
无菌的螺口塑料管中。
无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入
10ml螺口采样管中。
4.5
深咳痰液：
要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于50ml含3ml
采样液的螺口塑料管中。
4.6
呼吸道灌洗液：
将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管
（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓
慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（亦可用小孩导
尿管接在50ml注射器上来替代收集）。
4.7
胸水:
在B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于无菌的
塑料螺口管中。
4.8肺组织活检标本：
在超声或X线定位下,经皮穿刺取肺组织活
检标本,置于含3ml采样液的塑料螺口管中。
4.9尸检标本：
每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉
污染；
每种组织应多部位取材，各部位应取20～50g，淋巴结取2个。
4.10
粪便标本：
采集5～10g粪便置于含5～10ml采样液无菌螺口
管中，严格密封。
4.11血清标本：
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置
30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管
3
中。
注：
常用的采样液配方为：
pH7.4～7.6的Hanks氏液或
MEM/DMEM液。
在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为
100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为
2µ
g/ml）。
5标本包装
标本采集后在生物安全Ⅱ级实验室生物安全柜内分装成一式三份
（分装标本的生物安全柜不能用于提取核酸）。
一份当地检测用，一份
送中国疾病预防控制中心检测，一份保存以备复核。
5.1
所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的塑
料管里，拧紧。
容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。
5.2
将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份
标本。
5.3
标本有关信息填写“疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺
炎病例标本送检单”见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病
例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005]
526号），用另一塑料袋密封。
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标本保存
用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，24小时内能检
测的标本可置于4℃保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或
以下保存。
如无－70℃保存条件，则于－20℃冰箱暂存。
血清可在4℃
存放3天、-20℃以下长期保存。
标本运送期间应避免反复冻融。
标本
应设立专库或专柜单独保存。
7
标本送检
4
7.1
上送标本
检测结果阳性或可疑的原始标本或分离物应及时送中国疾病预
防控制中心复核和进一步检测；
省级疾病预防控制机构实验室检测阴
性，且有明确流行病学证据的病例的标本送中国疾病预防控制中心进
一步检测。
7.2
标本运送的生物安全要求
按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）和
《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》
（中华人民共和国卫生部第45号令）等有关规定执行。
7.3
标本送检的程序
各省（区、市）需要向中国疾病预防控制中心送检标本时，应事先
与中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室联系。
具体要求
见《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》
（中华人民共和国卫生部第45号令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不
明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中
疾控疾发[2005]526号）。
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实验室生物安全
从事人禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训和具备相
应的实验技能，在检测的过程中必须采取生物安全Ⅲ级防护。
不同的
标本检测生物安全级别要求如下。
8.1
标本的分装和核酸提取在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜
内进行，病毒培养物的核酸提取必须在生物安全Ⅲ级实验室的生物安
全柜内进行。
8.2
标本的抗原快速检测在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内
5
进行。
8.3
人禽流感病毒的分离、鉴定必须在生物安全Ⅲ级实验室里进
行。
8.4
采用灭活抗原进行血凝抑制试验检测血清抗体时，要求在生
物安全Ⅱ级实验室内操作。
采用微量中和试验进行血清抗体检测必须
在生物安全Ⅲ级实验室操作。
8.5
阳性标本和分离物的保存及销毁应按照《病原微生物实验室
生物安全管理条例》（国务院第424号令）执行。
9
标本的实验室检测
9.1
核酸检测：
方法包括RT-PCR和Real-Time
PCR，建议使用国
家流感中心或世界卫生组织推荐的引物和探针。
9.2
抗原快速检测方法包括ELISA法和金标法，本方法仅具参考
价值，不作为诊断依据。
9.3
病毒分离及鉴定：
采用SPF鸡胚和MDCK细胞分离方法。
病毒
的鉴定采用血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验或序列测定。
9.4
血清学检测：
方法包括微量中和试验、血凝抑制试验、单扩溶
血试验。
以上实验室检测方法详见《全国流感/人感染高致病性禽流感监
测实施方案》。
10
检测结果的判断和报告
10.1
各检测项目阳性报告
10.1.1
H5基因核酸检测：
A型特异性引物能够扩增出预期大小的
产物，两对H5亚型特异性引物都能够扩增出预期大小的产物。
10.1.2
抗原快速检测：
按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为
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阳性。
10.1.3
分离出病毒，并经鉴定为H5亚型或
H5N1亚型。
10.1.4血清学检测：
双份血清抗体滴度4倍或以上增高有诊断意
义。
10.2
各检测项目阴性报告
10.2.1
两对H5亚型特异性引物均不能够扩增
出预期大小的产物。
10.2.2
阴性。
10.2.3
病毒分离：
培养物红细胞凝集试验阴性。
10.2.4
血清抗体滴度＜1:
20为阴性。
10.3
H5基因核酸检测不一致
两对H5亚型特异性引物扩增出的产物检测结果不一致时，则对
阳性扩增产物进行测序，如果为H5N1病毒序列，则判断为阳性。
标本检测结果有关信息填写“人感染高致病性禽流感标本检测结
果反馈表”（具体见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例
标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》中疾控疾发[2005]
526号）。
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实验室检测流程
应采集人禽流感检测对象上呼吸道标本和下呼吸道标本进行禽
流感病毒的核酸检测和病毒分离，同时要采集病例的急性期和恢复期
血清标本进行
H5N1
亚型特异性抗体检测。
原则上，先由省级及以下疾病预防控制机构进行初步检测，阳性
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标本送中国疾病预防控制中心复核；
省级疾病预防控制机构实验室检
测阴性，且有明确流行病学证据的病例标本送中国疾病预防控制中心
进一步检测。
省级疾病预防控制机构不具备检测条件的，送中国疾病预防控制
中心或邻近具备相应条件和资格认证的省级疾病预防控制机构进行
检测。
具体步骤见人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图。
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人禽流感实验室检测职责
12.1
中国疾病预防控制中心职责
12.1.1对省级以及其它人禽流感检测实验室的检测结果进行复
核，并对上送的标本做进一步检测。
12.1.2
对不具备禽流感病毒核酸检测、病毒分离条件的省级上送
的标本进行检测。
12.1.3
对需做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验。
12.1.4
对分离到的禽流感病毒株做抗原及基因分析。
12.1.5
及时向送检标本的机构反馈检测结果。
12.1.6
对省级疾病预防控制机构实验室人员进行实验室技术和
生物安全培训。
12.1.7
对省级疾病预防控制机构实验室提供技术和试剂支持并
进行质量控制。
12.1.8
对省级疾病预防控制机构的实验室检测和生物安全工作
进行督导。
12.2
省级疾病预防控制机构职责
12.2.1对辖区内人禽流感标本的采集工作提供技术指导和物质
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支持，必要时直接参与标本的采集。
12.2.2
按照生物安全要求，对采集到的标本进行禽流感病毒的核
酸检测、血清学检测和抗原检测。
获得国家认证的生物安全Ⅲ级实验
室才可开展病毒分离和微量中和试验。
12.2.3
按照生物安全要求妥善保存原始标本或禽流感病毒株。
12.2.4
符合上送条件的标本或毒株按规定及时送中国疾病预防
控制中心。
12.2.5及时向中国疾病预防控制中心上报人禽流感检测的相关
信息。
12.2.6
12.2.7
根据疫情的发展和工作需要，向中国疾病预防控制中心申
请指定辖区内符合要求的国家级流感网络实验室开展相应的人禽流
感检测工作。
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人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图
标本采集对象
呼吸道、尸检标本、其它标本
RT-PCR
或
Real-Time
PCR
引物
至少应包括
A、两对
H5
血清标本
微量中和试验、HI
试验、
单扩溶血
A
及两对
H5
阳性
可
疑
两对
阴性
双份血抗体滴
度有
倍增高
度无
扩增产物
序列测定
再次采样、
再次检测
按照人流感
监测方法分
离鉴定*
报告
结果
采集检测
第三份血清
病毒分离和鉴定
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