分子生物学研究的内容Word格式文档下载.docx
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无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法
2.核酸变性程度的鉴定－紫外测定法：
v原理：
✓嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处
✓紫外光吸收值：
1双链DNAA260=1.00
2单链DNAA260=1.37
3自由碱基A260=1.60
3.熔解曲线与Tm值
缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到0.1℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线
熔链温度Tm：
OD增加值的中点温度（一般为85-95℃）
或DNA双螺旋结构失去一半时的温度
4.影响DNATm值大小的因素
vG-C含量：
Tm值计算公式：
Tm＝69.3+0.41（G+C）%
GC%=（Tm-69.3）×
2.44
v介质中的离子强度：
vDNA保存在高浓度的缓冲液中，如1mol/LNaCl中。
5.DNA复性（renaturation）
v变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为退火（annealing
vDNA的复性的条件有两个：
（1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；
（2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，
v一般使用比Tm值低20－25℃。
复性的机制
v一般认为需要10－20个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。
然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构
6.复性的影响因子：
v温度和时间：
低于Tm值25℃左右（60-65℃）
vDNA浓度：
vDNA片段的大小：
vDNA顺序的复杂性；
v反应溶液中的离子强度
四．DNA的超螺旋结构（三级结构
☐绝大多数原核生物及病毒的完整DNA分子都是共价封闭环（covalentlyclosedcircle,CCC）分子。
这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋.
☐真核生物线状DNA与蛋白质结合以环状的形成存在。
☐超螺旋结构是DNA三级结构的主要形式。
☐超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。
DNA生物合成
1.DNA复制方式：
v半保留复制
子代DNA分子双链的一条链总是来源于亲代DNA，采用半保留方式复制，原核生物及真核生物都采用该方式。
vDNA复制属性
复制原点、复制子、复制叉、复制速度。
2.DNA复制酶学基础
v底物（dAMP\dGMP\dCMP\dTMP）和dNTP
v模板
vDNA聚合酶
v其他酶和蛋白质因子
3.DNA复制过程
v复制起始
v复制的延伸
v复制的终止
4.原核生物和真核生物DNA复制的比较
相同点：
1）半保留复制方式
2）半不连续复制
3）DNA螺旋酶,SSBP
4）RNA引物
不同点：
1）复制起点（单、多）
2）复制子（大小、多少）
3）复制叉移动的速度
4）冈崎片段的大小
5）端粒和端粒酶
6）DNA聚合酶
RNA生物合成
1.原核生物转录机制
终止子
不依赖ρ因子/强终止子
（1）一个反向重复序列，可形成茎环结构，阻止RNApol的前进；
（2）茎区域内富含G-C，使茎环不易解开；
（3）3’端上有6个U，和模板形成的连续U-A配对较易打开，便于RNA释放。
2.真核生物转录机制
依赖ρ因子
v
（1）没有固定的特征，也可形成茎环结构，但不是都能形成稳定的发夹；
v
（2）茎中的G、C含量少。
v（3）3’端寡聚U数量不定；
v（4）靠与ρ的共同作用而实现终止。
v茎环的存在可使RNA聚合酶暂停一下，若此时ρ因子追上来和其结合，那么转录即可终止，若无ρ因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。
3.原核前体mRNA的加工
v原核生物的mRNA很少经过加工，由于转录和翻译偶联，一般情况下一边转录一边就进行翻译，中间没有可加工的间歇时间。
v但在少数情况下多顺反子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。
4.真核生物前体RNA的加工
1.5’端加帽
2.3’端的产生和多腺苷酸化
3.mRNA内部甲基化
4.RNA剪接
5.RNA编辑
遗传密码
1.通用三联体密码
1.密码子的简并性
2.密码子的通用性和特殊性
3.密码子的阅读方向
4.密码子与反密码子的作用
反密码子
与mRNA相应的三联体密码子碱基互密反补
▪摆动性：
mRNA密码子的前两位碱基和tRNA的反密码严格配对，而密码子第三位碱基与反密码子第一位碱基不严格遵守配对规则。
tRNA
1.tRNA结构
三叶草结构
2.tRNA的功能
1）解读mRNA的遗传信息
2）运输的工具，运载氨基酸
tRNA有两个关键部位：
●3’端CCA：
接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。
●与mRNA结合部位—反密码子部位
3.氨酰–tRNA合成酶（AARS）
★模板mRNA只能识别特异的tRNA而不是AA。
★氨基酸进入蛋白质合成途径是通过氨酰-tRNA合成酶（AARS），这种酶将氨基酸和特异的tRNA连接起来，成为氨基酰tRNA。
⏹原核生物中AARS有20种，对AA及tRNA高度专一，准确结合；
★大小：
40kDa~100kDa之间，有单聚体、二聚体和四聚体。
4.AARS识别tRNA的反应：
★需要三种底物AAtRNAATP
★因此有三个位点
AAbindingsite
tRNAbindingsite
ATPsite
★反应：
活化：
氨基酸+ATP+E→氨基酰-ATP-E+PPi
转移：
氨基酰-ATP-E+tRNA→aa-tRNA+AMP+E
5.翻译过程
1起始
组成过程：
30S+50S+mRNA+fMet-tRNAfmet
70S-mRNA-fMet-tRNAfmet+GDP+Pi
起始复合物---70S三元复合物
起始因子（Initiationfactor，IF）
vEcoli三种:
IF1IF2IF3。
vIF的性质特点：
IF
不同
形式
MW
GTP结合
能力
生物学活性
IF-1
9500
-
无特异功能，但具有加强IF2和IF3的活性作用。
IF-2
IF-2a
IF-2b
117000
85000
+
生成IF-2.GTP.fMet-tRNAfmet与前起始复合物结合形成30S三元复合物
IF-3
IF-3a
IF-3β
20668
19997
1.使得30S与mRNA结合，形成前起始复合物。
2.解离活性，使70S核糖体颗粒解离为30S和50S亚基。
30S亚基与mRNA的结合
IF3+30S--30S---IF3+mRNA--30S---IF3---mRNA（30S复合物）
☆IF3－－赋予30S亚基与mRNA结合的能力。
（30S亚基没有与mRNA主动结合的能力）
☆IF3使30S亚基不能与50S亚基结合，保证解离状态
☆30S亚基与mRNA的结合。
SD（5’-AGGAGG-3’）与16SrRNA的3’端（3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位上。
☆30S复合物中，起始密码子位于P位点，只有fMet-tRNAfMet能进入
起始tRNA的结合
IF2+fMet-tRNAf——IF2---fMet-tRNAf＋30S---IF3---mRNA----
30S---IF3---mRNA---IF2---fMet-tRNAf---GTP
70S起始复合物的形成过程
a、IF3先游离
30S---IF3---mRNA---IF2---fMet-tRNAf---GTP与50S亚基的结合导致。
b、70S起始复合物形成
◎50S亚基的结合激活IF2的GTP酶活性，水解GTP并解离下来（IF1、IF2）。
◎GTP水解释放的能量改变两者的构象形成70S起始复合物：
30S---mRNA---fMet-tRNA---50S
c、Met的甲酰基除去…..合成到15～30个AA
◎去甲酰基酶（细菌、线粒体）；
◎氨肽酶去除Met。
2延伸
延伸的三个阶段：
⑴进位反应：
主要是密码子-反密码子的识别；
⑵转肽反应：
肽链的形成；
⑶移位反应：
tRNA和mRNA相对核糖体的移动。
1）进位
v氨基酰-tRNA与核糖体结合，进入A位的过程。
v过程：
3终止
Ø
包括：
肽链释放，tRNA逐出，核糖体与mRNA解聚。
3.1终止密码UAA,UGA,UAG；
3.2释放因子（releasingfactor,RF）
释放因子
GTP结合能力
生物学活性
RF1
36000
识别UAA和UAG
RF2
38000
识别UAA和UGA
RF3
46000
+
刺激RF1，RF2的活性,
与GTP结合，使转肽酶构象改变，发挥酯酶活性，水解多肽、脱离tRNA
终止过程
a.RF1、RF2作用于A位点（P位被肽酰-tRNA所占据），识别终止密码子；
b.RF3作用改变肽基转移酶构象，从而改变肽基转移特性，发挥水解酶作用，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末端上水解下来，
mRNA与核糖体分离，tRNA脱落。
c.RF3与GTP结合为肽基转移及随后的核糖体释放提供能量。
d.同时核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基
vmRNA翻译的多肽链没有功能，称为新生蛋白质或蛋白质前体，需要经过加工改造才能成为有功能的蛋白质。
vmRNA的信息阅读：
5’端向3’端，
v肽链延伸：
从N端到C端。
真核生物的基因组结构
1．真核生物基因组的大小
2．真核生物基因组的基因数量
3．真核生物基因组的非重复序列和重复序列
4．细胞器基因组
真核生物基因组的非重复序列和重复序列：
1.高度重复序列
2.中度重复序列
3.非重复序列
细胞器基因组：
1.线粒体基因组
2.叶绿体基因组
第二节 断裂基因
1．断裂基因由外显子与内含子组成
2．外显子
3．内含子
第三节 基因家族和基因簇
1．基因家族
1.基因家族的成因
2.基因家族的特点
3.假基因
4.常见基因家族
第四节 真核生物基因组的包装
一.染色质的结构单位：
核小体
由核心颗粒和连结DNA两部分组成：
①每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1；
②组蛋白核心：
由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体；
③DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合；
④相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。
第五章原核生物基因的表达调控
第一节基因表达调控的概念
基因表达：
储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。
☹基因表达调控：
对基因表达过程的调节。
v生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受着严密、精确调控:
1.5原核生物基因表达调控环节：
①转录水平上的调控；
②转录后水平上的调控：
a.mRNA加工成熟水平上的调控；
b.翻译水平上的调控。
2结构基因和调控基因
结构基因（structuralgene）：
编码蛋白质或RNA的任何基因。
z原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。
调控基因（regulatorgene）：
参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的编码基因。
其编码产物与DNA上的特定位点结合调控基因表达
第二节大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控
一、操纵子与操纵子模型
原核生物基因表达调控主要发生在转录水平，转录调控的基本单元是操纵子。
1、操纵子的概念：
根据操纵子学说，很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。
包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子
v2、操纵子结构
由启动子（P）、操纵基因（O）、调控基因、结构基因所组成。
二、正调控与负调控
v1、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator），激活蛋白结合与DNA的启动子及RNA聚合酶后，转录才会进行。
（1）在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。
（2）在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行
2、在负转录调控系统中，调节基因的物质是阻遏蛋白（repressor）－－阻止结构基因转录。
其作用部位是操纵区。
它与操纵区结合，转录受阻。
（1）负控诱导系统－－阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。
（2）负控阻遏系统－－阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。
名词
v正调控
v负调控
v诱导
v阻遏
v激活蛋白
v阻遏蛋白
v诱导物
v辅阻遏物
调控模式
1、可诱导负调控
2、可诱导正调控
3、可阻遏负调控
4、可阻遏正调控
三、大肠杆菌乳糖操纵子的负调控
（一）大肠杆菌的乳糖利用系统
大肠杆菌的乳糖代谢需要有β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的催化。
这种酶能把乳糖水解为半乳糖和葡萄糖.另外有半乳糖苷透性酶和巯基半乳糖苷转乙酰酶。
三种酶协同作用，使得乳糖得以分解和利用。
乳糖操纵子的结构和功能
结构
基因
3个不同结构基因能够产生3种不同的酶.
操纵
是结构基因的开关.通过对RNA聚合酶阻抑与否来控制结构基因的转录或停止.
启动子
是RNA聚合酶与DNA结合的部位,可识别转录起始点.
调节
能产生阻遏物.通过阻遏物与操纵基因的结合与否来控制操纵基因的关闭和开启
二）乳糖操纵子的调控机制
1、没有乳糖时，具有活性的阻遏物和操纵基因结合，转录不能进行。
2、有乳糖时，乳糖与阻遏物结合，使阻遏物发生构象变化而失活，不能与操纵子结合，结构基因正常转录，进而再翻译出蛋白质。
四、大肠杆菌乳糖操纵子的正调控
1、葡萄糖敏感操纵子
有一些控制某一种糖如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖等分解代谢的操纵子，当培养基含有葡萄糖时，会阻止这些操纵子的功能，称为葡萄糖敏感操纵子。
例如：
当大肠杆菌生长的培养基中既有葡萄糖又有乳糖的条件，只利用葡萄糖，而不利用乳糖。
换句话说，只要在培养基中有葡萄糖存在，便可抑制了利用其他各种酶的产生，称为分解物阻遏。
v2、CAP-cAMP调控
另外一种起调节作用的诱导物为cAMP（环化腺苷酸）
分析一组实验几种情况：
（1）当培养基中含用大量葡萄糖时，cAMP水平明显下降。
（2）当以乳糖为唯一碳源时，cAMP水平明显上升，β-半乳糖苷酶的合成增加。
3）当有乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP，β-半乳糖苷酶的合成速率大大提高。
结论：
？
cAMP浓度能影响到β-半乳糖苷酶的合成速率。
主要是cAMP能激活CAP（分解物基因激活蛋白），起转录因子的作用。
3、lac操纵子的正调控机制
（1）cAMP-CAP复合物与DNA结合，改变DNA结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链，从而促进RNA聚合酶和启动子结合，使转录能力增强。
（2）cAMP-CAP复合物的形成取决于AMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP，cAMP浓度下降，不能形成cAMP-CAP复合物，乳糖结构基因不能被转录。
（因为细胞中有葡萄糖作为能源，就没有必要需要对乳糖利用的几种酶了）
v四、色氨酸操纵子的转录调控及衰减作用
1．色氨酸操纵子模型：
操纵子：
包括色氨酸合成有关的5种酶的结构基因；
大量色氨酸时：
大肠杆菌5种酶的转录同时受到抑制；
色氨酸不足时：
这５种酶的基因开始转录；
色氨酸：
作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构基因的转录。
∴ trp操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型（repressibleoperon）。
v色氨酸操纵子模型结构：
5种结构基因：
trpE、D、C、B、A；
调控结构：
启动子、操纵子、前导序列、弱化子；
阻遏物trpR基因：
与trp操纵子相距较远；
v2.色氨酸操纵子的负调控：
⑴.阻遏调控：
trpR基因编码无辅基阻遏物与色氨酸结合形成有活性的色氨酸阻遏物与操作子结合阻止转录；
色氨酸不足：
阻遏物三维空间结构发生变化，不能与操作子结合，操纵元开始转录；
色氨酸浓度升高：
色氨酸与阻遏物结合，空间结构发生变化，可与操作子结合，阻止转录。
v⑵.弱化子调控：
当有色氨酸存在而trp操纵子受抑制时，仍有一段前导序列发生转录，可能存在另一种的机制来抑制trp操纵元的转录。
色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列140bp长，其中有一28bp的弱化子区域；
形成发夹结构，为内部终止子，RNA酶从DNA上脱落，不能转录；
色氨酸低浓度或不存在时，RNA聚合酶能通过弱化子区域，转录完整的多顺反子mRNA序列；
第七章基因突变和修复
第一节基因突变
一、基因突变的类型
1.碱基置换和移码突变
2.同义突变、错义突变和无义突变
3.自发突变和诱发突变
4.点突变和染色体变异
5.突变和回复突变
v移码转换和颠换
v突变
转换（transition）:
一种嘌呤-嘧啶对被另一种嘌呤-嘧啶对所替换。
颠换（transvertion）:
一种嘌呤-嘧啶对被另一种嘧啶-嘌呤对所替换。
移码突变（frame-shiftmutation
基因组DNA链中插入或缺失1个或几个碱基对，从而使自插入或缺失的那一点以下的三联体密码的组合发生改变，进而使其编码的氨基酸种类和序列发生变化。
v无义突变（non-sensemutation）
碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码UAA、UAG或UGA。
v错义突变（missensemutation）
碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。
v自发突变：
主要来源于复制错误及DNA自发水解和脱氨等产生的自发损伤。
（碱基的互变异构、脱氨作用、脱嘌呤脱嘧啶、碱基修饰与链断裂）
v诱发突变:
物理、化学或生物因素诱发产生的突变。
v碱基类似物
某些碱基类似物可以取代碱基而插入DNA分子引起突变。
v芳香族化合物
吖啶类和焦宁类等扁平分子构型的芳香族化合物可以嵌入DNA的核苷酸序列中，导致碱基插入或丢失的移码突变。
二、基因突变的特点
1.普遍性
2.基因自发突变频率很低（10-6-10-9）
3.多数基因突变对生物体有害
4.基因突变的随机性和不定向性
第三节直接修复
1．DNA聚合酶的校正功能
2．嘧啶二聚体的光复活修复
3．烷基转移酶介导的修复
一、DNA聚合酶的校正功能
v原核生物DNA聚合酶3‘-5’外切校对活性
v真核生物DNA聚合酶3‘-5’外切校对活性
第四节错配修复系统
1．错配修复系统根据不同甲基化程度识别模板链和新生链
第五节切除修复系统
1．碱基切除修复
1.DNA糖基化酶的作用
2.AP内切酶的作用
3.氧化碱基的修复
第六节重组修复
1．同源重组修复
第八章基因重组和转座
第一节同源重组
一、同源重组的分子机制
1.同源重组的条件
交换区具有相同或相似的序列
双链DNA分子间互补配对
重组酶的存在
异源双链区的形成
二、同源重组的酶学机制
-RecABCD、RuvABC途径
vRecBCD蛋白在chi位点3’侧的一条链上产生切口。
vRecBCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使chi位点附件切口的DNA解链
v单链区被RecA蛋白和SSB蛋白覆盖
vRecA蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分
vD－loop区域的DNA产生切口，新切口的3’端（thetailofnewlynickedDNA）与另一条DNA的单链区互补配对
vDNA连接酶封闭切口，形成Hollidayjunction
vRuvA和RuvB发动迁移反应
vRuvC拆分重组中间体
第二节位点特异性重组
v位点特异性重组最典型的列子是λ噬菌体对E.coli的整合。
在裂解周期，λDNA是以环状分子独立存在于细菌的细胞质中；
在溶原化状态时的λDNA是整合在细菌的染色体中。
称为原噬菌体。
通过位点特异性重组这两种状态是可以相互转变的。
v进入溶原状态时游离的λDNA必须整合（intergrated）到宿主的DNA中；
从溶原周期
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