对紫外可见分光光度法的原理和应用的讨论Word下载.docx

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一束复合光通过分光系统，将其分成一系列波长的单色光，任意选取某一波长的光，根据被测物质对光的吸收强弱进行物质的测定分析，这种方法称为分光光度法。

分光光度法所使用的仪器称为分光光度计。

紫外可见分光光度计种类和型号较多，常用的有72型、721型、752型等。

各种型号的分光光度计的基本结构都相同，由五部分组成：

①光源（钨灯、卤钨灯、氢弧灯、氘灯、汞灯、氙灯、激光光源）；

②单色器（滤光片、棱镜、光栅、全息栅）；

③样品吸收池；

④检测系统（光电池、光电管、光电信增管）；

⑤信号指示系统（检流计、微安表、数字电压表、示波器、微处理机显像管）。

单色器是将来自光源的混合光分解为单色光，并提供所需波长的光，是仪器的关键部件。

它是由入口与出口狭缝、色散元件和准直镜等组成，其中色散元件是关键性元件，主要有棱镜和光栅两类。

3.1.1棱镜单色器

光线通过一个顶角为θ的棱镜，从AC方向射向棱镜，如图1所示，在C点发生折射。

光线经过折射后在棱镜中沿CD方向到达棱镜的另一个界面上，在D点又一次发生折射，最后在空气中DB方向行进。

图1棱镜的折射

光线经过此棱镜后，传播方向从AA′变为BB′，两方向的夹角δ称为偏向角。

偏向角与棱镜的顶角θ、棱镜材料的折射率以及入射角i有关。

如果平行的入射光由λ1，λ2，λ3三色光组成，且λ1<

λ2<

λ3，通过棱镜后，就分成三束不同方向的光，且偏向角不同。

波长越短、偏向角越大，如图2所示，δ1>

δ2>

δ3。

这即为棱镜的分光作用，又称光的色散。

棱镜分光器就是根据此原理设计的。

图2不同波长的光在棱镜中的色散

棱镜是分光的主要元件之一，一般是三角柱体。

由于其构成材料不同，透光范围也就不同。

比如，用玻璃棱镜可得到可见光谱用石英棱镜可得到可见及紫外光谱，用溴化钾（或氯化钠）棱镜可得到红外光谱等。

棱镜单色器示意图如图3所示。

图3棱镜单色器示意图

1-入射狭缝；

2-准直透镜；

3-色散元件；

4-聚焦透镜；

5-焦面；

6-出射狭缝

3.1.2光栅单色器

单色器还可以用光栅作为色散元件，反射光栅是由磨平的金属表面上刻划许多平行的、等距离的槽构成。

辐射由每一刻槽反射，反射光束之间的干涉造成色散。

3.1.3721型和752型分光光度计的原理和结构

Ⅰ、721型分光光度计

721型分光光度计是可见光分光光度计，是72型分光光度计的改进型，适用波长范围368nm~800nm，主要用作物质定量分析。

它由磁饱和稳压器、光源、单色光器和测光机构、微电计组成。

其内部构造和光路系统如图4和图5。

图4721型分光光度计内部结构图

1-光源；

2-单色光器；

3-比色皿槽；

4-光量调节器；

5-光电管暗盒部件；

6-微安表；

7-稳压电源

图5721型分光光度计电路和系统示意图

1-光源灯；

2-透镜；

3-棱镜；

4-准直镜；

5、13-保护玻璃；

6-狭缝；

7-反射镜；

8-光栏；

9-聚光透镜；

10-比色皿；

11-光门；

12-光电管

721型分光光度计是根据相对测量原理工作的。

即先选定某一溶剂作为标准溶液，设定其透光率为100%，被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的，即让单色光分别通过被测试样和标准溶液，二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。

如图所示，白色光源经入射狭缝、反射镜和透光镜后，变成平行光进入棱镜，色散后的单色光经镀铝的反射镜反射后，再经过透镜并聚光于出射狭缝上，狭缝宽度为0.32nm。

反射镜和棱镜组装在一可旋转的转盘上并由波长调节器的凸轮所带动，转动波长调节器便可以在出光狭缝后面选择到任一波长的单色光。

单色光透过样品吸收池后由一光量调节器调节为适度的光通量，最后被光电电池吸收，转换成电流后由微电计指示，从刻度标尺（或盘）上直接读出透光率的值。

Ⅱ、752型分光光度计

752型分光光度计为紫外光栅分光光度计，测定波长200nm~800nm。

752型分光光度计由光源室、单色器、样品室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成，仪器的工作原理如图6所示。

图6752型分光光度计结构原理示意图

仪器内部光路从钨灯或氢灯发出的连续辐射经滤色片选择聚光镜聚光后投

向单色器进狭缝。

狭缝位于聚光镜及单色器内准直镜的焦平面上，进入的复合光通过平面反射镜反射及准直镜，变成平行光射向色散光栅。

复合光通过光栅的衍射作用，形成按照一定顺序均匀排列的连续单色光谱。

单色光谱重新返回准直镜，然后按照聚光原理成像在出射狭缝上。

出射狭缝选出指定带宽的单色光通过聚光镜，落在试样室被测样品中心，样品吸收后透射的光经光门射向光电管阴极面。

根据光电效应原理，会产生一股微弱的光电流。

经电流放大器放大，送到数字显示器，测出透光率或吸光度；

或通过对数放大器实现对数转换，显示出被测样品的浓度C值。

光路系统如图7所示。

图7752型分光光度计光学系统图

1-钨灯；

2-滤色片；

3-氢灯；

4-聚光镜；

5-进狭缝；

6-保护玻璃；

8-准直镜；

9-光栅；

10-保护璃；

11-出狭缝；

12-聚光镜；

13-样品；

14-光门；

15-光电管

3.2紫外可见分光光度计仪器的使用方法

两种分光光度计（752型分光光度计与721型分光光度计）的使用方法类似。

步骤分述如下，

（1）仪器通电前，检查供电电源与仪器所需电压是否相符，然后接通电源，预热二十分钟。

（2）通过波长选择旋钮，使波长读数窗内指示在所需波长刻度线上。

（3）通过T、A、C选择钮，将仪器置“T”测试状态。

（4）通过灵敏度旋钮，选择合适的放大灵敏度。

本仪器设置8档，其中1档最低。

选择原则是:

保证“T”值调到“100%”的前提下，尽可能采用灵敏度较低档。

这样仪器的稳定性更好。

（5）将被测试样倒入比色皿内，其中第一格放置比试样。

（6）调零。

打开样品室盖板，光门自动关闭；

调节“0”旋钮至仪器显示“0.000”。

（7）调100%。

盖上样品室盖板，光门自动打开；

将参比试样推入光路中，调节“100”旋钮至仪器显示“100.00”。

如调不到“100”，可增大一档灵敏度。

（8）测“T”值。

将被测试样依次推入光路，即可在显示器上读取到“T”值。

（9）测“A”值。

把选择开关置于“A”档，依次将被测试样推入光路，即可在显示器上读取到“A”值。

（10）测“C”值。

将选择开关置于“C”档，把配置好的标准浓度试样推入光路，调节浓度旋钮显示已知的标准浓度值；

然后依次将被测试样推入光路，即可在显示器上读取到“C”值。

4紫外可见分光光度法的应用

4.1定性分析

4.1.1定性分析的依据

用紫外可见分光光度法进行定性分析时，主要根据吸收光谱的形状、吸收峰的数目、

εmax（λ）以及λmax。

4.1.2定性分析方法

（1）用经验规则计算λmax与测定λmax比较

Woodward规则：

计算共轭二烯、多烯烃、共轭烯酮类化合物π→π*最大吸收波长的经验规则。

Scott规则：

计算芳香族羰基衍生物的π→π*最大吸收波长的经验规则。

（2）比较吸收光谱

此方法是通过未知物与标准物质吸收光谱的比较，推断出未知物。

在进行比较未知物与标准物质时，需在相同化学环境与测量条件下的紫外-可见吸收光谱，若两物质的吸收光谱的形状、吸收峰数目、εmax（λ）、λmax完全相同，就可以确定未知物与标准物质具有相同的生色团和助色团。

4.1.3定性分析方法缺陷

使用紫外可见分光光度法进行定性分析时，只能定性分析化合物所具有的生色团与助色团，而且光谱信息在紫外-可见光谱范围重叠现象严重。

4.2定量分析

4.2.1单组份定量方法

（1）标准曲线法：

用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线，此标准曲线应是通过原点的直线。

若标准曲线不通过原点，则说明存在系统误差。

标准曲线的斜率即为绝对校正因子。

测定样品中的组分含量时，用与绘制标准曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准曲线上直接查出注入色谱柱中样品组分的浓度。

标准曲线法的优点是：

绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。

标准曲线法的缺点是：

每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。

此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

（2）标准对比法：

该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由

Ax=kcx

求出cx。

该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。

4.2.2多组分定量方法

该方法是由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。

设试样中有两组份X和Y，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图8的三种情况：

图8多组分吸收法出现的不同吸收情况

图（a）：

X,Y组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。

图（b）和（c）：

X,Y相互干扰，此时可通过解联立方程组求得X和Y的浓度：

其中，X,Y组份在波长λ1和λ2处的摩尔吸光系数ε可由已知浓度的X,Y纯溶液测得。

解上述方程组可求得cx及cy。

4.2.3双波长法（等吸收点法）

当混合物的吸收曲线重迭时，如图9所示，可利用双波长法来测定。

图9混合物吸收重叠吸光度时的示意图

具体做法：

将a视为干扰组份，现要测定b组份。

a） 

分别绘制各自的吸收曲线；

b） 

画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交；

c） 

以交于a上一点所对应的波长λ1为参比波长，另一点对应的为测量波长λ2，并对混合液进行测量，得到：

A1=A1a+A1b+A1s

A2=A2a+A2b+A2s

若两波长处的背景吸收相同，即A1s=A2s

二式相减，得，DA=（A2a-A1a）+（A2b-A1b）

由于a组份在两波长处的吸光度相等，因此，

DA=（A2b-A1b）=（ε2b-ε1b）lcb

从中可求出cb，同理，可求出ca。

4.2.4系数倍率法

该方法使用情况情况同双波长法。

但其中一干扰组份b在测量波长范围内无吸收峰时，或者说没有等吸收点时可采用该法。

同前法可得到下式，

A1=A1a+A1b

A2=A2a+A2b

两式分别乘以常数k1、k2并相减，得到，

S=k2（A2a+A2b）-k1（A1a+A1b）=（k2A2b-k1A1b）+（k2A2a-k1A1a）

调节信号放大器，使之满足k2/k1=A1b/A2b，则

S=（k2A2a-k1A1a）=（k2ε2-k1ε1）lca

因此，差示信号只与ca有关，从而求出ca。

同样可求出cb。

4.2.5示差分光光度法

该方法的测量原理是当试样中组份的浓度过大时，则A值很大，会产生读数误差。

此时若以一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有：

以浓度为cs的标准溶液调T=100%或A=0（调零），所测得的试样吸光度实际就是上式中的DA，然后求出Dc，则试样中该组份的浓度为（cs+

c）。

4.2.6导数光谱法

该方法是将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。

导数光谱是解决干扰物质与被子测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提高光谱分辨率的一种数据处理技术。

该方法基于，已知

，对波长求一阶导数，得

控制仪器使I0在整个波长范围内保持恒定，即dI0/dλ=0，则

即一阶导数信号与浓度成正比。

同样可得到二阶、三阶….n阶导数信号亦与浓度成正比。

随导数阶数的增加，峰形越来越尖锐，因而导数光谱法分辨率高。

吸收峰数为：

导数阶数+1，即n+1。

测量导数峰高时，可以使用①正切法：

相邻峰（极大或极小）切线中点至相邻峰切线（极小或极大）的距离d；

②峰谷法：

两相邻峰值（极大或极小）间的距离；

③峰零法：

极值峰至零线间的距离。

4.2.7配合物组成和稳定常数测定

（1）摩尔比法（饱和法）

该方法是，先设配合物的显色反应为：

具体做法为，固定cM，增加cR，并测定一系列MRn的吸光度A，以cR/cM比值对A作图。

其中，曲线拐点处对应的值为配合比n。

设MRn电离度为α，则

2）等摩尔连续变化法（Job法）

该方法的具体做法为，保持cR+cM=c恒定，但改变cM与cR的相对比例，若以cM/c对吸光度A作图，当达最大吸光度时cM/cR之比即为配位比。

由两曲线外推的交点所对应的cM/c亦可得出配位比。

若比值为0.5，则配位比n为1:

1；

若比值为0.33，则配位比n为1:

2……或者n=（1-cM/c）/（cM/c），设cM/c=f，则

因此，

该法适于离解度小、配合比低的配合物组成测定。

4.2.8弱酸离解常数的测定

设有一元弱酸HB，其离解反应如下：

若测出[B-]和[HB]，即可求出Ka。

测定时，配制三份不同pH值的溶液。

一份为强碱性，一份为强酸性，分别在B-和HB的最大吸收波长处测定吸光度，求出各自的摩尔吸光系数。

第三份为已知pH值的缓冲溶液，分别在B-和HB的最大吸收波长处测得总吸光度，解联立方程求得[B-]和[HB]，然后按前式求出pKa或Ka。

4.3纯度检查

如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中的杂质有在紫外-可见区有较强的吸收，就可方便地检出该化合物中的痕量杂质。

如，检测甲醇或乙醇中的杂质苯，可利用苯在256nm出的B吸收带，而甲醇或乙醇在此波长处几乎没有吸收。

如果一化合物，在可见区或紫外区有较强的吸收带，有时可用摩尔吸收系数来检查其纯度。

如，菲的氯仿溶液在296nm处有强吸收（lgε=4.10）；

干性油含有共轭双键，而不干性油是饱和脂酸酯或虽不是饱和体，但其双键不相共轭。

不相共轭的双键具有典型的烯键紫外吸收带，其所在的波长较短；

共轭双键谱带所在波长较长，且共轭双键越多，吸收谱带波长越长。

因此饱和脂酸酯及不相共轭双键的吸收光谱一般在210nm以下。

含有两个共轭双键的约在220nm处，三个共轭双键的在270nm附近，四个共轭双键的则在310nm左右，所以干性油的吸收谱带一般都在较长的波长处。

工业上要设法使不相共轭的双键变为共轭，以便将不干性油变为干性油，因此使用紫外吸收管够的观察是判断双键是否移动的一个简便方法。

4.4紫外可见分光光度计在环境监测中的应用举例

4.4.1水浊度的测定

水浊度测定中，选择以甲腊聚合物（由硫酸肼和六次甲基四胺反应而成）配制标准浊度溶液，将用分光光度计置于680nm波长处测其吸光度，与在同样条件下测定水样的吸光度比较，即可得知其浊度。

4.4.2双硫腙分光光度法测定水样中的金属

（1）测定汞

水样中存在着汞的两种形态（有机态和无机态），将水样在存在酸性条件下，加入氧化剂，并在95℃下加热。

各种形态的汞转变为[Hg2+]，此时向溶液调制酸性，并向其中加入双硫腙溶液，生成橙色螯合物，再由四氯化碳液萃取后，即可在485nm波长下测量其吸光度。

通过绘制标准曲线，可做定量测量。

与测定水中汞的原理相似，双硫腙分光光度法也可测定，

（2）测定镉

在强碱性介质中，将水样其与双硫腙溶液反应生成红色螯合物，利用CHCl3萃取后，在波长为518nm处即可测量。

（3）测定铅

需将水样调至pH8.5~9.5之间，在氨性柠檬酸盐-氰化物介质中，将水样与双硫腙溶液反应生成红色螯合物，由CHCl3（CCl4）萃取，在波长510nm处进行测定。

（4）测定锌

将水样调至pH4.0~4.5，锌离子与双硫腙反应生成红色螯合物，由CHCl3（CCl4）萃取，在波长为535nm处进行测定。

4.4.3测定水样中的铜

方法

（1）将水样调至pH9~10，使用DDTC试剂，生成黄棕色胶体络合物，使用CHCl3（CCl4）萃取，在波长为440nm处即可进行测定。

方法

（2）在中性或微酸介质中，Cu+与新亚铜灵反应生成黄色螯合物，使用CHCl3-CH3OH萃取，在波长为457nm处即可进行测定。

4.4.4测定水样中的铬

测定水样中的铬，需要使用的配合剂是DPC（二苯碳酰二肼）

（1）六价铬的测定

六价铬与DPC反应生成紫红色螯合物，可在波长为540nm处进行测定。

（2）总铬的测定

此时需先将三价铬氧化为六价铬（可使用高锰酸钾氧化），经氧化后，水样中的铬均为六价态，此时可通过加入DPC与六价铬反应生成紫红色螯合物的方法测定。

在氧化过程中，对于过量的高锰酸钾，可用亚硝酸钠进行分解，过量的亚硝酸钠可通过加入尿素将其分解。

4.4.5水样中总氮的测定

在水样中加入碱性过硫酸钾溶液，于过热水蒸气中将大部分有机氮化合物及氨氮、亚硝酸盐氮氧化成硝酸盐，再用紫外分光光度法测定硝酸盐氮含量，即为总氮含量。

4.4.6水样中磷（总磷、溶解性磷酸盐和溶解性总磷）监测

在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑氧钾反应，生成磷钼杂多酸，再被抗坏血酸还原，生成蓝色络合物（磷钼蓝），在700nm波长处可测量其吸光度，使用标准曲线法进行定量测量。

该方法最低检出浓度为0.0lmg/L，测定上限为0.6mg/L。

适用于地表水和废水。

4.4.7大气中氮氧化物的检测方法

大气中氮氧化物包括一氧化氮及二氧化氮等。

在测定氮氧化物时，先用三氧化铬氧化管将一氧化氮氧化成二氧化氮。

二氧化氮被吸收液吸收后，生成亚硝酸和硝酸。

其中亚硝酸与对氨基苯磺酸氮化反应，再与盐酸萘乙二胺偶合，生成玫瑰红色偶氮染料，根据颜色深浅，可在波长为540nm处进行光度测定。

4.4.8大气中二氧化硫浓度的测定

气样中的二氧化硫被甲醛缓冲液吸收后，生成稳定的羧甲基磺酸加成化合物，加碱后又释放出二氧化硫与盐酸副玫瑰苯胺作用，生成紫红色络合物，其颜色深浅与SO2含量成正比，可用分光光度法测定。

气样中二氧化硫的固定还可使用四氯汞钾缓冲溶液。

除以上几种组分外，紫外可见分光光度法还可检测很多环境监测中需要测定的组分，再次不一一列出。

4.5紫外可见分光光度法在其他领域的应用

4.5.1异构化菜油中共轭亚油酸的测定

此测定需采用WFZUV-2102C型紫外分光光度计，该分析可适用于样品中共轭亚油酸同分异构体总量的定量测量，共轭亚油酸的特征吸收峰在230~235nm，并且在测定环境温度25℃、波长234nm处，控制待测样液中共轭亚油酸浓度不大于40μg/mL的条件下共轭亚油酸的总量与吸光度呈线性相关关系。

4.5.2叶绿素的测定

由于叶绿素中有主要有chla与chlb，两相混合很难直接测出。

将叶片在乙醇或丙酮溶液中浸提或者研磨后，在光谱扫描中可得到645nm和663nm两个吸收峰。

因此将预处理得到的提取液在此两个波长处分别测得吸光度Na、Nb，由经验公式得

式中，M为原始叶片重量，Ca、Cb、Ct分别为被测叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的浓度值，chla、chlb、chl分别为此种植物的叶绿素a的含量，叶绿素b的含量，总叶绿素的含量。

4.5.3纺织品甲醛含量的测定

（1）1.甲醛样品溶液的获取

获取方法主要有水萃取法和蒸气吸收法。

主要介绍一下水萃取法，水萃取法是指将经过精确称量的试样在40℃水浴中萃取一定时间，从织物上萃取的甲醛被水吸收，制成具有一定甲醛浓度的待测品水溶液。

待测纺织品不需要打湿，否则影响样品中的甲醛含量。

在检测前，应把被检测的样品放入一个聚乙烯包装袋里储藏，为防止甲醛通过包装的气孔扩散出去，可在聚乙烯包装之外再包以用铝箔制成的袋子并将其封闭好。

一般只取1g~5g的样品。

具体操作方法如下：

①首先将纺织品剪成3~5mm的碎片；

②然后精确称量10mg，放入250ml带塞子的锥形瓶中；

③用100ml的量筒称取100ml的3级水（即蒸馏水），盖紧塞子，同时要做三个一样的样品（即平行分析）；

④放入40℃土2℃的恒温水浴振荡器中振荡60min土5min；

⑤用2号玻璃漏斗式过滤器过滤至另一个锥形瓶或是烧杯中。

（2）测量溶液的吸光度

用单标移液管吸取5ml已过滤的样品溶液和5ml标准甲醛溶液（注：

可自配或到国家标准物质中心等处购买）放入不同的比色管中，分别加入5ml乙酰丙酮溶液（在1000ml容量瓶中加入150g分析纯乙酸铵，用800ml水溶解后加入分析纯冰乙酸和2ml分析纯乙酰丙酮，用水稀释至刻度，储存12h后使用）。

同时用5ml的3级水加5ml乙酰丙酮溶液做试剂空白对照，用“A1”表示。

如果样品褪色的话，还要取5ml已过滤的样品溶液加5ml的3级水做样品空白对照，用“A2”表示。

把上述准备好的比色管放在40℃土2℃的恒温水浴振荡器中显色30min土5min，然后取出，常温放置30min土5min，1cm的比色皿（吸收池）放在紫外可见分光光度计上，以412波长测定吸光度，用“A3”表示。

将测定数据全部记录下来。

（3）检验结果的计算

各种检测后用下列公式来校正样品的吸光度：

式中，A—校正吸光度；

A1—空白试剂中测得的吸光度；

A2—空白样品中测得的吸光度（仅用于变色或沾污的情况下）；

A3—检验样品中的吸光度。

用校正后的吸光度数值，通过工作曲线查出甲醛含量，用μg／ml表示。

用下式计算出每一样品中萃取出的甲醛含量：

式中，F—从织物样品中萃取的甲醛含量，mg／kg；

C—读自工作曲线上的萃取液中的甲醛浓度，mg／L；

M—试