子任务6实施方案厦门大学苹果酸脱氢酶制备关键工程化技术研究与应用Word格式文档下载.docx
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通讯地址
福建厦门思明区南路422号
邮政编码
361005
联系人
姓 名
谢淑明
处（室）
科技处
职务
科长
联系电话
传真
2180407
手机
电子信箱
项目起始时间
项目完成时间
实施年限
4年
项目子任务
经费预算
120万元
财政拨款
120 万元
其他财政拨款
万元
单位自有货币资金
其他资金
子任务负责人
姓名
方柏山
出生日期
学位
■博士□硕士□学士□其他
性别
男
职称
教授
专业
生物工程
所在单位
厦门大学化学化工学院
身份证号码
350500
手机号码
办公电话
参加人数
10人。
其中：
高级1人，中级2人，初级人，其他人；
博士0人，硕士1人，学士6人，其他人。
累计工作时间
196人月
研究类型
□行业应用基础研究□行业重大公益性技术前期预研
■行业实用技术研究开发□国家标准和行业重要技术标准研究
□计量、检验检测技术研究
创新类型
□自主创新■集成创新□引进消化吸收再创新
预期成果与
应用类型
■形成专利□形成国家标准和行业重要技术标准
■形成实用技术自主研发能力□局部试点示范
□业务化运行□较大范围推广应用□研究报告
□形成海洋开发与管理应用理论或公益技术□论文论著
研究内容
（200字以内）
开发海洋高产苹果酸脱氢酶的菌株高通量筛选技术，获得高活性苹果酸脱氢酶的海洋微生物出发菌株；
利用环境胁迫对菌株进行驯化或利用分子生物学手段对菌株进行改造，优化苹果酸脱氢酶的发酵生产工艺，提高苹果酸脱氢酶的产量；
完成苹果酸脱氢酶耐高温、耐有机溶剂、稳定性等催化特性的考察；
进行100L规模的发酵培养，优化海洋微生物发酵生产苹果酸脱氢酶的分离纯化工艺。
考核指标
1.建立环境胁迫驯化菌株或分子生物学手段改造苹果酸脱氢酶基因的苹果酸脱氢酶高效表达新技术，获得高产苹果酸脱氢酶的海洋微生物菌株3-5株；
2.获得100L级苹果酸脱氢酶发酵中试工艺技术；
3.苹果酸脱氢酶比活性达到40U/mg，每升发酵液苹果酸脱氢酶活性达到15000U；
4.完成苹果酸脱氢酶分离纯化工艺优化，酶纯化倍数大于20；
5.申请国家专利1~2项。
编写说明
1．本实施方案由项目子任务承担单位负责编写。
2．编写要求：
（1）总体目标、年度目标要完整、集中、明确、可考核，要充分考虑经济、技术等方面的可行性；
（2）研究任务和内容重点突出，技术路线清晰，技术关键点与创新点明确；
（3）项目子任务的组织实施管理等符合项目的特点，配套条件要保障落实，措施具体；
（4）经费预算根据充分，符合规定。
3．报告涉及到外文缩写要注明全称。
4．方案文本采用A4幅面纸，小四号宋体字打印，标题用小四号黑体字打印，表格用五号宋体字打印，行距25磅，页码居中，按项目编号顺序附项目实施方案后合并装订，由项目承担单位和项目子任务承担单位盖章后报国家海洋局海洋科学技术司，同时报送电子版本。
5、其他说明：
（1）《海洋公益性行业科研专项经费项目信息表》“子任务承担单位信息－联系人”指项目子任务承担单位科技处相关负责人。
（2）承担单位意见和项目子任务承担单位意见必须加盖法人单位公章，二级学院或重点实验室等盖章无效。
（3）子任务编号格式为“项目编号—1”、“项目编号—2”，依次顺延。
项目子任务实施方案填报内容
一、项目及项目子任务概述
项目概述
海洋公益性行业科研专项“基于海洋微生物发酵的新产品开发技术研究与应用”面对海洋生物资源可持续利用产业发展需求，依托海洋微生物发酵工程技术，围绕海洋生物活性产物规模化制备关键技术，研究开发新技术、新工艺和新制品，提升我国海洋活性产物领域的技术创新能力和研究水平，形成系列海洋活性产物成套技术和产品。
项目选择应用价值高、市场前景好的S-腺苷甲硫氨酸、隐甲藻胞外免疫多糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻黄素、褐藻胶改性专用裂解酶和苹果酸脱氢酶等重要海洋功能产物，利用现有的种质遗传改良技术，对目标菌（藻）株进行诱变育种和活性物质调控，从而有效提升海洋微生物（微藻）活性产物的产量；
建立活性产物生产菌（藻）株的种质改良、规模化发酵、分离提取和检测、活性控制、应用示范等共性关键技术研发链条；
着力突破中试工艺技术瓶颈，实现从实验室研发到生产应用的连接，构建海洋微生物（微藻）规模化发酵和分离提取的中试研发平台，实现目标产物高效、经济培养；
建立目标产物分离提取和检测等关键技术，实现绿色清洁生产；
对开发的新产品进行功能、活性、质量和安全性评价，为其产业化生产奠定基础。
形成市场前景广阔、具有自主知识产权的成果，开发出多项产业化前景显著的高附加值产品。
“苹果酸脱氢酶制备关键工程化技术研究与应用”作为海洋公益性行业科研专项“基于海洋微生物发酵的新产品开发技术研究与应用”项目的子任务之一，主要针对当前苹果酸脱氢酶制备过程中的共性和关键问题，通过开发海洋高产苹果酸脱氢酶的菌株高通量筛选技术，获得高活性苹果酸脱氢酶的海洋微生物出发菌株；
进行100L规模的发酵培养，优化海洋微生物发酵生产苹果酸脱氢酶的分离纯化技术，实现苹果酸脱氢酶制备关键工程化技术研究与应用。
本子任务由厦门大学所牵头，国家海洋局第一海洋研究所协同参与共同完成。
子任务经费共120万元，投入工作量共196人月。
二、必要性及需求分析
1.必要性
苹果酸脱氢酶是生物体三羧酸循环的关键酶之一，可用于拆分D，L-苹果酸得到D-苹果酸。
D-苹果酸是一种非天然有机酸,是一种极其重要的四碳有机手性源,主要用于合成泛酸、生物碱和信息素等手性药物和手性化合物，还可以作为手性的添加剂、助剂和药物等，具有较大的市场应用前景。
由于苹果酸脱氢酶在临床诊断中也有着广泛的用途，可用于心肌梗塞、急性实质性肝损伤、肝癌、白血病的早期诊断和鉴别诊断；
还可以将苹果酸脱氢酶应用于发酵过程中有机酸的检测,如L-苹果酸、醋酸、柠檬酸的检测；
在谷草转氨酶（AST/GOT）连续监测试剂盒的配制中，必须加入苹果酸脱氢酶作为指示酶反应。
以制备的苹果酸脱氢酶和谷草转氨酶配成双酶反应体系。
通过海洋微生物发酵生产苹果酸脱氢酶，可望有效降低该酶的生产成本，为其工业化生产和应用奠定基础。
2.需求分析
近年来国际市场对其的需求量保持高速的增长。
D-苹果酸是一种非天然有机酸，是一种极其重要的四碳有机手性源，主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域，可用于合成泛酸、β-内酰胺类抗生素、信息素和生物碱等手性药物。
传统化学法合成的手性药物多数以消旋体形式上市,1992年美国FDA开始要求手性药物以单一对映体形式上市。
手性药物的最大特点是疗效确切，副作用小，临床用量少。
手性药物的制备已引起了国内外医药界的广泛重视。
随着医药工业的发展,近年来，全世界对D-苹果酸的需求量增加，从而引起了许多国家对D-苹果酸的研究和生产的兴趣。
目前国内的D-苹果酸几乎全部依赖进口。
特别地，苹果酸脱氢酶可应用于食品中检测柠檬酸、L-苹果酸等有机酸含量和在医疗中用于血液中CO2、天冬氨酸转移酶的检测及草酰乙酸和苹果酸含量的分析，作为临床诊断、医学研究用的试剂具有较大的市场应用前景。
三、国内外技术现状、发展趋势
目前对于苹果酸脱氢酶的研究主要集中在分子生物学领域，如尹奇等人利用RACE技术从木薯华南8号块根中获得苹果酸脱氢酶MDH基因，并研究其在转录水平的表达变化规律。
童永亮等人以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板，通过PCR技术扩增出牛型布鲁氏菌MDH的编码基因mdh。
PCR产物经酶切后与表达载体pET-28a（+）连接，成功构建pET-28a-MDH重组质粒，转化入大肠杆菌BL-21（DE3），经IPTG诱导表达后，成功表达大小约为36KDa的融合蛋白His-MDH。
通过优化表达条件，His-MDH主要以可溶性方式表达，利用表达载体pET-28a（+）上的6His-Tag标记，通过Ni+亲和层析柱成功对His-MDH进行纯化，为迸一歩研究该蛋白的酶学性质及免疫学特性奠定基础。
由于目前发现苹果酸脱氢酶广泛分布于动物各组织，尤以心、肝、肾、骨骼肌最为丰富，因此有关苹果酸脱氢酶的制备见于报道的主要是从动物心脏（如猪心）中分离提取的。
猪心苹果酸脱氢酶存在两种类型，一种是线粒体苹果酸脱氢酶（m-MDH），另一种是可溶性或细胞质苹果酸脱氢酶（s-MDH）。
国内曾报道过张元亮等人对猪心苹果酸脱氢酶的提取纯化研究，用匀浆提取、90%硫酸沉淀和CM-纤维素柱层析、SephadexG-150、G-100、G-75柱层析的方法从猪心中分别制备了猪心线粒体苹果酸脱氢酶（粗提液中比活13U/mg）和猪心肌细胞质苹果酸脱氢酶（粗提液中比活13U/mg），但是其提取方法复杂而且比酶活和回收率不高。
龚韧等人设计并优化了从猪心中提取高纯度苹果酸脱氢酶（粗提液中比活mg）的技术路线，采用组织破碎、二度硫酸铵盐析、DEAESepharoseF.F.离子交换层析、PhenylSepharose6F.F.疏水层析及SephadexG-75Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化，其提取方法仍然较复杂。
以至于到目前为止国内还没有苹果酸脱氢酶产品生产。
1975年，Heard等首次给出eMDH在基因组染色体上的精确位置（min）。
1985年，Pamela等为了进一步考察苹果酸脱氢酶的结构及物种进化关系，首次克隆、表达大肠杆菌中的苹果酸脱氢酶。
随后于1987年eMDH被克隆和精确测序，为此后对蛋白质分子的进一步的研究奠定了基础。
同年，Vogel等从含有编码eMDH功能基因的质粒pLC32-38上克隆了eMDH的编码基因，将其与质粒pUC19连接构建重组质粒，在E.coli中诱导表达后得到了高于野生菌40倍活性的eMDH。
1989年，Nicholls等从W3899染色体中克隆了eMDH的编码基因，在自带启动子的作用下进行表达，表达产物中可溶蛋白质达50%以上。
1995年，Soon等体外构建了mdh-lacZ融合表达质粒，并考察不同培养条件对eMDH表达的影响。
结果表明，在大多数培养基中，有氧条件下eMDH的表达量都优于无氧条件。
同时，eMDH的表达量受到培养基中的碳源种类的影响。
2003年，杨柳青等人根据大肠杆菌DNA中苹果酸脱氢酶的序列合成上下游引物,以大肠杆菌E.coliDH5α基因组为模板通过PCR扩增得到苹果酸脱氢酶的基因,将该基因与表达载体pET28a连接构建重组子,将该重组子转化入大肠杆菌E.coliBL21构建工程菌,通过IPTG诱导表达苹果酸脱氢酶,并初步测定了该菌株拆分DL-苹果酸的能力。
但是由于他们使用的目的基因来源于E.coliDH5α，在用PCR检测重组子是否为阳性时，使用设计的上游引物W42492出现假阳性；
为避免质粒的小量抽提产物和酶切产物中的杂质对一些核酸内切酶和T4-DNA连接酶活力的影响，必须用试剂盒对其进行纯化回收，才能提高酶切和连接的效率。
为了获得苹果酸脱氢酶包含体的有效体外复性方法，近年来，张拓宇等人将渗透剂（蔗糖、甜菜碱、海藻糖）与人工伴侣体系（CTAB/B-CD）耦合，进行了大肠杆菌苹果酸脱氢酶（e-MDH）包含体的体外复性研究。
结果发现，人工伴侣与蔗糖或甜菜碱耦合,可明显提高e-MDH包含体的复性效果，复性后产物的活性较稀释复性提高了2倍以上。
海洋微生物的特殊生境，蕴育着众多具有特殊功能的氧化还原酶生产菌。
因此，从海洋微生物中发掘氧化还原酶已经成为该类酶开发的趋势。
本课题的前期工作中发掘的苹果酸脱氢酶为本课题的研究奠定了重要的基础，对其研究和开发可望明显降低该酶的生产成本，早日实现其工业化生产和应用。
四、项目子任务研究目标及主要研究任务
1.项目子任务研究目标
（1）总体目标
通过改变苹果酸脱氢酶的制备方式，开发海洋微生物发酵法生产苹果酸脱氢酶新工艺，克服当前苹果酸脱氢酶制备方法复杂、比酶活不高、环境污染严重等问题，达到降低苹果酸脱氢酶制备成本、提高苹果酸脱氢酶活性、减少污染物排放、促进苹果酸脱氢酶广泛应用的总目标。
（2）年度目标
开发海洋高产苹果酸脱氢酶的菌株高通量筛选技术，获得3-5株高产苹果酸脱氢酶的海洋微生物出发菌株。
利用环境胁迫对出发菌株进行驯化或利用定向进化技术对出发菌株进行改造，优化苹果酸脱氢酶的发酵生产工艺，提高苹果酸脱氢酶的产量。
完成苹果酸脱氢酶耐高温、耐有机溶剂、稳定性等催化特性的考察。
进行100L规模的发酵培养，优化海洋微生物发酵生产苹果酸脱氢酶的分离纯化工艺。
（3）考核指标
建立环境胁迫驯化菌株或分子生物学手段改造苹果酸脱氢酶基因的苹果酸脱氢酶高效表达新技术，获得高产高产苹果酸脱氢酶的海洋微生物菌株3-5株；
获得100L级苹果酸脱氢酶发酵中试工艺技术；
苹果酸脱氢酶比活性达到40U/mg，每升发酵液苹果酸脱氢酶活性达到15000U；
完成苹果酸脱氢酶分离纯化工艺优化，酶纯化倍数大于20；
申请国家专利1~2项。
1.主要研究任务
高通量发掘高活性苹果酸脱氢酶的海洋微生物出发菌，开发苹果酸脱氢酶出发菌的代谢进化技术、定向进化技术、中试发酵技术、高效分离提取技术。
主要研究任务有：
（1）高活性苹果酸脱氢酶的海洋微生物菌株选育
开发高通量苹果酸脱氢酶海洋微生物的筛选技术，扩大海洋微生物菌株选育范围，获得高活性苹果酸脱氢酶的海洋微生物菌株3-5株；
（2）高活性苹果酸脱氢酶的海洋微生物菌株改造
利用环境胁迫对菌株进行代谢进化或利用分子生物学手段对菌株进行定向进化，提高苹果酸脱氢酶活性；
（3）苹果酸脱氢酶理化性能考察
全面考察苹果酸脱氢酶耐高温、耐有机溶剂、稳定性等催化特性；
（4）苹果酸脱氢酶发酵工艺优化
进行100L规模的发酵培养，应用最优化方法优化苹果酸脱氢酶发酵培养基的组成和配方、发酵工艺参数，研究苹果酸脱氢酶发酵动力学，提高苹果酸脱氢酶发酵水平，进一步降低其生产成本。
（5）苹果酸脱氢酶分离提取保藏工艺优化
利有机结合超声波或高压匀浆细胞破碎法、离子交换法、亲和层析法和冷冻干燥法，建立和优化苹果酸脱氢酶的高效分离提取和保藏工艺，提高苹果酸脱氢酶的纯度、活性和稳定性。
2.技术路线
技术路线如图1所示：
图1苹果酸脱氢酶制备研究技术路线图
3.项目的技术关键，包括技术难点、创新点
技术难点：
（1）海洋假单胞菌的菌株驯化与苹果酸脱氢酶体外定向进化技术；
（2）苹果酸脱氢酶生产菌的高效发酵技术；
（3）苹果酸脱氢酶高效分离纯化技术。
创新点：
（1）针对当前从动物心脏（如猪心）中分离提取苹果酸脱氢酶的方法复杂、比酶活不高等问题，创新性地开发海洋微生物发酵法生产苹果酸脱氢酶的方法；
（2）针对当前构建苹果酸脱氢酶基因工程菌过程酶切和连接效率低、存在包含体需体外复性等困难，率先开展苹果酸脱氢酶体外定向进化。
五、预期成果及技术、经济效益分析
规模化运用本项目制备苹果酸脱氢酶，可望提高苹果酸脱氢酶产量，有效降低对动物心脏（如猪心）中分离提取苹果酸脱氢酶的依赖和制备过程对环境的污染；
可望实现D-苹果酸生产的国产化，满足世界对D-苹果酸日益增长的需求，促进医药工业的发展；
可望降低应用苹果酸脱氢酶于食品监测和医疗检测的成本，拓展其在临床诊断、医学研究中的应用市场。
这对加速沿海海洋生物技术领域自主创新能力的提高，培育海洋生物制品等海洋新兴产业，形成以海洋生物技术为核心的现代化海洋科技中试基地，促进形成具有地方海洋产业特色的创新体系具有重大意义和带来显著的经济和社会效益。
六、实施年限和年度工作计划
1.实施年限
项目计划实施4年，2015年1月至2018年12月。
2.年度工作计划
开发海洋高产苹果酸脱氢酶的菌株高通量筛选技术，筛选高产目标产物的海洋微生物。
利用环境胁迫对菌株进行驯化或利用分子生物学手段对菌株进行改造，优化苹果酸脱氢酶的发酵生产工艺，提高苹果酸脱氢酶的产量。
考察苹果酸脱氢酶耐高温、耐有机溶剂、稳定性等催化特性。
100L规模的发酵培养条件优化，研究由海洋微生物发酵生产的苹果酸脱氢酶的分离纯化和冷冻干燥工艺，检测苹果酸脱氢酶的理化性质，撰写技术报告。
七、经费预算及来源渠道
项目子任务经费预算表
金额单位：
序号
预算科目名称
合计
专项经费
自筹经费
1
一、经费支出
（一）直接费用
3
1、设备费
4
（1）购置设备费
5
（2）试制设备费
6
（3）设备改造与租赁费
7
2、材料费
8
3、测试化验加工费
9
4、燃料动力费
10
5、差旅费
11
6、会议费
12
7、国际合作与交流费
13
8、出版/文献/信息传播/知识产权事务费
14
9、劳务费
15
10、专家咨询费
16
11、其他
17
（二）间接费用
18
1、现有仪器设备及房屋、水、电、气、暖消耗
19
2、管理费用补助支出
20
3、绩效支出
21
4、
22
二、经费来源
23
1、申请从专项经费获得的资助
24
2、自筹经费来源
25
（1）其他财政拨款
26
（2）单位自有货币资金
27
（3）其他资金
专项经费拨付进度申请
第1年
第2年
第3年
第4年
金额
比例
%
该承担单位/协作单位的间接费用占本项目总间接费用的比例
八、前期基础、组织措施及实施方式
1.前期基础（项目子任务承担单位已有科研条件和配套条件落实情况）
（1）承担单位已有科研条件
承担单位厦门大学现有三个国家重点实验室（近海海洋环境科学国家重点实验室、表面物理化学国家重点实验室、细胞应激生物学国家重点实验室和一个国家工程实验室（醇醚酯化工清洁生产国家工程实验室）和厦门市合成生物技术重点实验室和多个“211工程”实验室，拥有国际上先进的相关仪器设备与实验条件，非常有利于本研究工作的开展，有助于达到预期的研究目标。
承担单位国家海洋局第三海洋研究所拥有国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室、山东省海洋生物制品工程中心、青岛市海洋天然产物重点实验室、青岛市海洋天然产物中式基地，拥有高效液相色谱、气（液）质联用仪、激光共聚焦显微镜、超高速离心机、高压细胞破碎仪、10~500升系列生物发酵罐、GE蛋白纯化系统、微生物生化鉴定仪、分子蒸馏装置等仪器设备，为项目的实施提供了较好的科研条件和配套条件。
（2）配套条件落实情况
厦门市合成生物技术重点实验室可为本项目的实施提供配套的实验条件，子任务负责人方柏山教授为该重点实验室主任和厦门大学化学化工学院生物化工研究所所长，能够确保配套条件的有效落实。
（3）前期研究基础
子任务负责人长期从事合成生物学与酶工程的研究，先后负责863计划项目子课题2项、主持国家自然科学基金重点项目1项和面上项目7项、高等学校博士学科点专项科研基金资助项目1项、福建省自然科学重点项目基金资助项目2项、福建省高校产学合作科技重大项目1项、福建省重点科技基金、福建省自然科学基金等资助项目5项、企业委托项目3项。
项目技术负责人方柏山教授正在开展的与本课题密切相关的国家级项目如下：
国家自然科学基金重点项目：
“多酶生物分子机器的可控组装与制备药物的生物化工基础（,）”、国家自然科学基金面上项目：
“深海细菌Pseudomonasmarincola的氧化还原酶高通量挖掘、特异性研究与应用（，）”和“海洋微生物依赖NADH胺脱氢酶的底物特异性研究与催化性能调控（，）”，已授权和公开的相关专利有：
一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，授权日：
；
一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，公开号：
CN102703574A；
一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用，公开号：
CN102732488A；
一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，公开号：
CN103224963A。
这些工作为本课题的顺利开展奠定了坚实的前期研究基础。
其中，与本课题直接相关的前期工作是：
我们就所获得的16种海洋微生物：
Pseudomonasbalearica、Pseudomonasbeteli、Pseudomonasindoloxydans、Pseudomonasflavescens、Pseudomonasmarincola、Pseudomonasborbori、Pseudomonasmarincola、Pseudomonasgeniculata、Pseudomonaskilonensis、Pseudomonasfrederiksbergensis、Pseudomonasfragi、Exiguobacteriumprofundum、Marinobacteralgicola、Citreicellamarina、Citreicellathiooxidans、Novosphingobiumsp.，对其中心碳代谢（CCM）的关键氧化还原酶：
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶以及异柠檬酸脱氢酶的发掘条件进行研究，通过研究底物浓度、辅酶浓度、反应温度、反应缓冲液以及金属离子对酶活检测的影响，建立了CCM关键氧化还原酶系的高通量检测平台和海洋微生物氧化还原酶信息库。
图2为其中一海洋微生物中心碳代谢（CCM）的关键氧化还原酶酶活性随时间变化的示意图。
研究发现其中的苹果酸脱氢酶（图2中f）酶比活高达60U⋅mg-1（粗酶液），是已报道的来自猪心肌的苹果酸脱氢酶酶比活的高6倍，急需进一步拓展海洋微生物挖掘范围和扩大苹果酸脱氢酶的制备规模等研究。
图2来自某海洋微生物的六种CCM关键氧化还原酶比活力随培养时间的变化
2.组织管理的措施
（1）统筹分工、责任到人，发挥队伍成员研发优势
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