试验一人基因组DNA的提取.docx

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试验一人基因组DNA的提取

第四章　基因检测相关的实验

人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。

疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。

其中分子诊断技术已在许多临床领域得到运用，这必将为二十一世纪人类医疗保健带来福音。

因此，从分子水平上了解医学遗传学相关的实验技术对于现代医学教育与医学实践具有十分重要的意义。

实验4-1人基因组DNA的提取

一、实验目的

掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。

二、实验原理

从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。

制备高质量DNA的原则是：

①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；②尽可能保持DNA分子的完整。

在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。

SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：

①破坏细胞膜及核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；④抑制DNA酶活性，使DNA分子尽量完整地分离出来。

三、实验用品和材料

（一）试剂

1．抗凝剂：

EDTA2%（W／V）生理盐水抗凝剂。

称取2gEDTANa2、0．85gNaC1，加双蒸水至100m1。

1ml该试剂可抗10ml全血凝结；亦可用医用人ACD抗凝剂抗凝。

肝素能抑制限制性内切酶活性，因此一般不用肝素抗凝。

2．15mmo1／LTris-HCl（pH8.0），15mmo1／LEDTA（pH8.0），15mmo1／LNaCl（简称TES溶液）；用lmo1／LTris-HCl（pH8.0），0.5mmo1／LEDTA（pH8.0），3mo1／LNaCl稀释成15mmo1／LTES溶液。

3．10%（W／V）SDS。

4．15mmo1／LTES饱和酚，重蒸酚在热水浴（100℃）中溶化后加入1/3体积的15mmo1／LTES溶液，充分混匀后，放冰箱中静置6h以上。

酚层在下，水层在上。

吸掉上层多余的TES溶液，冰箱中避光保存备用。

为防止酚被氧化成酮，可加少量8-羟基喹啉（2mmo1／L～5mmo1／L）。

5．氯仿／异戊醇（24：

1，V/V），现配现用。

6．蛋白酶K。

7．10mmo1／LTris-HCl，1mmo1／LEDTA（pH7.5）（简称TE溶液）。

用1mo1／LTris-HCl（pH7．5），0．5mo1／LEDTA（pH7．5～8．0）稀释配制。

（二）用品：

Eppendorf试管、离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽。

四、实验方法和步骤

1．白细胞的分离

（1）抗凝血用1～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。

（2）在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。

（3）室温以2000rpm离心15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。

（4）吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。

（5）用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。

（6）最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱中，直至使用。

2．DNA的提取

（1）在5m115mo1／LTES中悬浮白细胞，加蛋白酶K250μg～350μg（50μg/m1～70μg/m1），10%SDS至终浓度0.5%（加260μl左右）。

（2）充分混匀，放50℃水浴中保温3h～5h，其间振摇2～3次。

（3）冷却至4℃，加等体积15mo1／LTES饱和酚。

（4）轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。

（5）4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。

此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。

（6）用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。

注意尽量不要带出中间蛋白层。

（7）DNA溶液再加等体积15mo1／LTES饱和酚抽提一次，按（5）、（6）离心并吸至另一离心管。

（8）加等体积氯仿/异戊醇按步骤（4、5）抽提，离心5min。

（9）吸出DNA溶液后，再步骤（8）抽提一次。

（10）用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。

（11）加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。

（12）用75%冷乙醇清洗3～4次。

（13）室温干燥或冷冻干燥DNA。

（14）加适量TE溶液溶解DNA。

3．DNA的鉴定及定量

（1）比色法：

取DNA溶液20μl，用蒸馏水稀释至400μl。

以蒸馏水做空白，在紫外分光光度计上测定OD260、OD280、OD230三个数值。

对于纯DNA，1个OD260=50μg/mlDNA，因此DNA含量应为50μg/ml×OD260×稀释倍数。

按上述稀释20倍样品读数，50μg/ml×20倍等于1mg／m1，因此所读出的OD260数值即为样品稀释前的浓度（mg／m1）。

例如OD260数值为0.54，则DNA浓度为0．54mg／m1。

根根含量计算总DNA得量。

计算公式为：

DNA浓度量（mg／m1）×体积（m1）

例如DNA样品0.5m1，浓度为0．54mg／m1，则DNA总量为：

0．54mg／m1×0.5m1=0.27mg＝270μg。

经上述方法制备的DNAOD260／OD280＞1.7，OD260／OD230＞2.0。

OD260／OD280比值太小，说明样品中残存蛋白质较多；OD260／OD230比值太小，说明样品中残存核苷酸、氨基酸或酚等有机杂质。

（2）电泳鉴定：

取样品1μl，加电泳缓冲液5μl和加样缓冲液2μl（含溴酚蓝指示剂及甘油），在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳。

用噬菌体λDNA作为标准。

DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA相同或稍慢，证明分子量均>50kb。

一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。

如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子，不能再用来进行限制性内切酶图谱分析。

五、注意事项与实验报告

（一）注意事项

1．酚抽提时如果上清液太粘，不能和蛋白层分开时，可加入适量的TES稀释，然后再用酚抽提。

2．保温可在45℃～55℃范围内进行。

3．抽提DNA时动作不可过猛，以防机械震动将DNA分子打得太碎。

4．沉淀DNA时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。

5．DNA溶于TE时可先浓一点，发现太浓时再加些TE。

这样能保证DNA样品不致于太稀而无法使用，一般来讲，DNA浓度为0.4mg/ml～0.6mg/ml最为理想。

（6）溶于TE中的DNA样品比较稳定，可在4℃冰箱中存放一年而不会降解。

（四）预期实验结果及分析

1．获得高质量的DNA；

2．分析电泳结果，指出实验成功或不足的原因，形成实验报告后交老师。

（王培林）

实验4-2聚合酶链反应

聚合酶链反应（polymeraschainreaction，简称PCR）是体外特异性扩增DNA分子的一项技术。

它是美国Cetus公司人类遗传学研究室的科学家Kary.B.Mullis在1985年发明的。

Mullis等在建立PCR方法初期，仅采用非常简单的三种温度的水浴进行实验，应用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段催化复性引物的延伸反应。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR；随着自动化扩增仪的发明和发展PCR技术得到极大的推广应用，近年更是迅速渗透到生命科学的各个领域，成为分子生物学最重要的技术之一。

PCR主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段，其特异性主要由人工合成的与待扩增的DNA片段两条链两端已知序列分别互补的一对寡核苷酸引物决定。

PCR反应体系由引物、微量的DNA模板，四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）溶液，耐热TaqDNA聚合酶，Mg2+及适量的缓冲液等组成。

反应时首先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为复性或退火；再将温度升至中温，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5′→3′方向延伸，合成新的DNA片段，该片段又可作下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增（图4-1）。

图4-1PCR原理图

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

如此大量扩增的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳即可得以检测分析，另外PCR产物还可用于核酸探针杂交、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析等。

由于该法操作简单，实用性强，特异性和灵敏度高，并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究、以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等的基因诊断和研究中得到广泛应用。

一、实验目的

1．掌握PCR技术的基本原理；

2．了解应用PCR技术检测性别决定基因的基本过程。

二、实验原理

SRY基因位于人类Y染色体，是1990年Sinclair等克隆的睾丸决定基因，X染色体上没有相应的同源节段。

根据SRY基因序列合成一对特异性引物，通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病患儿的出生。

三、实验准备

（一）材料

人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml及0.5mlEppendorf管。

引物序列：

SRY1：

5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′

SRY2：

5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′

（二）试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理）

1．生理盐水

2．细胞裂解液

50mmolTris-HCl（pH8.0）

1mmolNa2EDTA（pH8.0）

0.5%SDS

0.1mmolNaCl

3．10mg/ml蛋白酶K

4．20%SDS

5．水饱和酚（1mol/LTris-HCl抽提）

6．酚：

氯仿：

异戊醇（25∶24∶1）

7．氯仿：

异戊醇（24∶1）

8．8mol/L醋酸钾

9．无水乙醇

10．70%乙醇

11．TE（pH8.0）

10mmol/LTris-HCl　pH8.0

0.1mmol/LNa2EDTApH8.0

12．10×buffer

500mmol/LKCl

100mmol/LTris·HCl（pH8.3，室温）

15mmol/LMgCl2

0.1%明胶

13．4×dNTP

1mmol/L　dATP、1mmol/LdCTP、1mmol/LdGTP、1mmol/LdTTP

14．Taq酶　1U/μl

15．引物溶液10pmol/μl

16．5×TBE缓冲液（1000ml）：

54gTris碱、27.5g硼酸、20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）。

17．DNA分子量标记

18．2%琼脂糖凝胶

19．载样缓冲液（100ml）：

0.2%溴酚蓝、50%蔗糖、10mol/LNaOH12滴。

20．10mg/ml溴化乙锭溶液：

戴手套谨慎称取溴化乙锭（分子量394.33）约200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水20ml，溶解后置4℃冰箱保存备用。

使用时100ml琼脂糖凝胶中加5μl10mg/ml溴化