微生物实验补充Word下载.docx

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2．平板分离法

该方法操作简便，普遍用于微生物的分离和纯化。

其基本原理包含两方面：

（1）稀释技术：

通过稀释涂布平板和平板划线挑取单个菌落，从而获得纯培养。

（2）选择培养技术：

如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件（如营养、酸碱度、温度和氧气等）来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。

但是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。

三、实验仪器和试剂

1．器材

（1）玻璃培养皿：

直径9cm。

（2）玻璃涂布棒。

（3）血细胞计数板。

（4）普通光学显微镜。

（5）移液器及吸头：

1mL，5mL。

（6）摇床：

200转/分钟。

（7）试管：

20mL。

（8）三角瓶：

250mL。

（9）洁净操作台：

洁净度为ISO5（100级）。

（10）其他：

电子天平、量筒、容量瓶、接种环等。

2．试剂

（1）酚溶液（10%）：

量取10mL酚加入到100mL容量瓶，用去离子水定容至100ml。

（2）链霉素溶液（50mg/mL）：

称取链霉素50mg溶于1mL无菌水中。

3．培养基

（1）高氏一号琼脂培养基（淀粉琼脂培养基）

（2）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

（3）马丁氏琼脂培养基

四、实验方法和步骤

1．稀释涂布平板法

（1）倒平板

将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和马丁氏琼脂培养基加热融化，待冷却至55～60º

C时，在高氏一号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终浓度为50g/mL），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒3皿。

图7.8-1倒平板操作图

倒平板的方法：

右手持装有琼脂培养基的三角瓶置于火焰旁边，用左手将三角瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞（如果三角瓶内培养基一次用完，瓶塞则不必夹在手中）。

左手拿培养皿并将皿盖在火焰旁边打开一缝，迅速倒入培养基约15mL（图7.8-1），盖好后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于水平桌面上，待培养基凝后即为平板。

（2）制备土壤稀释液

称取土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，200转/分钟振荡20min，使土样和水充分混合。

使用无菌吸头吸取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的试管中充分混匀，然后从此试管中吸取1mL溶液加入到另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀。

以此类推从而得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。

（3）涂布

图7.8-2平板涂布操作图

使用无菌吸头吸取10-4、10-5和10-6三个稀释度的土壤溶液各0.1mL加入到已凝好的平板中，使用无菌玻璃涂布棒按图7.8-2所示，在培养基表面涂布均匀，室温下静置20min，使菌液吸附进培养基。

平板涂布方法：

将0.1mL菌悬液小心滴在平板培养基表面中央区域，右手拿无菌玻璃涂布棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布棒再涂布几次。

（4）培养

将高氏一号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28º

C培养箱中培养3～5天，牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于37º

C培养箱中培养2～3天。

（5）挑菌落

挑取培养后长出的单个菌落接种到上述三种培养基的斜面上，分别置于28º

C和37º

C培养箱中培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。

若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2．稀释涂布平板法

按照稀释涂布平板法倒平板。

（2）划线

在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑起上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。

常用的划线方法有两种：

图7.8-3划线方法示意图

①用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70º

角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线（图7.8-3，A）。

划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于培养箱中培养。

②用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，在平板培养基上作连续划线（图7.8-3，B）。

（3）挑菌落

同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物为纯培养为止。

五、实验数据记录和处理

1．记录涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？

如果不是，请分析原因并重做。

2．记录牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和马丁氏琼脂培养基平板上分离到的微生物菌落特征，初步分析属于哪些类群的微生物。

六、思考题

1．什么是微生物的纯培养？

如何确定平板上某单菌落是否为纯培养？

请写出实验步骤。

2．如果一项科学研究需要分离自然界中的产蛋白酶菌株，你将如何完成？

请写出简明的实验方案（提示：

产蛋白酶菌株在酪素平板形成讲解酪素的透明圈）。

实验7.10细菌生长曲线的测定

细菌生长曲线是指将少量纯种细菌接种到恒定容积的液体培养基中，在适宜的温度和通气等条件下培养，菌体就会迅速增殖，以培养时间作横坐标，以菌体数目的对数值作纵坐标绘制的曲线。

不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下绘制的生长曲线也不相同。

测定细菌的生长曲线，了解起生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

（1）掌握细菌生长曲线的特征及测定原理。

（2）学会光电比浊法测定细菌数量的方法、绘制细菌生长曲线的方法。

（3）了解细菌代时的定义，明确细菌代时的计算方法。

大多数细菌的繁殖速度很快，例如：

在合适的条件下，一定时期内的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。

将少量纯种细菌接种到恒定容积的液体培养基中，在适宜的温度和通气等条件下培养，菌体就会迅速增殖，以培养时间作横坐标，以菌体数目的对数值作纵坐标绘制一条由延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段组成的曲线称之为细菌生长曲线（图7.10-1）。

图7.10-1细菌生长曲线示意图

1．延滞期；

2．对数期；

3．稳定期；

4．衰亡期

（1）延滞期（lagphase）：

又称调整期。

细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂的适应过程，不适应着因转种而死亡。

此期曲线平坦稳定，细菌生长速度极低。

延滞期长短因菌种、接种数量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4h。

（2）对数期（logarithmicphase）：

又称指数期。

此期生长曲线上细菌数直线上升。

细菌以稳定的几何级数极快增长，因菌种、接种数量、菌龄以及营养物质等不同可持续几小时至几天不等。

此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期最佳。

（3）稳定期（stationaryphase）：

又称平台期。

该期细菌生长曲线处于平坦期。

由于培养基中营养物质消耗、毒性物质（有机酸、H2O2等）积累、pH下降等不利因素的影响，细菌生长速度渐趋下降，细菌死亡率逐渐上升，改期细菌增指数和死亡数趋于平衡。

（4）衰亡期（declinephase）：

随着稳定期的发展，细菌繁殖越来越慢，死亡率明显增高。

活菌数与培养时间呈反比关系，细菌生理代谢活动趋于停滞。

由于细菌悬液的浓度与浑浊度成正比，因此可利用光电比浊法测定菌悬液的OD值来推知菌液的浓度，细菌细胞数量越多，培养基的浊度也越大，在分光光度测定时所吸收的光线越多。

测定完整的细菌生长曲线方法是在细菌培养过程中定时取样测定菌体生长量，一般常需24h左右。

本实验是以活菌计数法与光电比浊法相对应来测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线，从而观察分析大肠杆菌在这些培养条件下的生长情况。

如果样品液层厚度一定，OD值与样品的浊度相关，据此原理，可通过测定样品在600nm处的光密度值OD600，来代表培养液中的浊度即微生物量（见公式7.10-1）。

（7.10-1）

式中：

It——透过光的强度，cd；

I0——入射光强度，cd；

K——吸光系数，L/gcm；

c——样品液的浓度，g/L；

d——液层厚度，cm；

It/Io：

称透光度（transmittance）；

：

称消光系数（opticaldensity，简称OD）。

从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。

其计算公式为：

（7.10-2）

G——代时，h；

t1——对数期一时刻，h；

t2——对数期一时刻，h；

W1——t1时刻培养液OD600值；

W2——t2时刻培养液OD600值。

（1）分光光度计：

波长范围为350～770nm（可见光）。

（2）恒温摇床：

37º

C，200转/分钟。

（3）三角烧瓶：

（4）洁净操作台：

（5）其他：

电子天平、比色皿、量筒、容量瓶、接种环、移液器及吸头等。

2．培养基

牛肉膏蛋白胨液体及琼脂培养基

3．菌种

大肠杆菌（Escherichiacoli）

1．准备菌种：

将大肠杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37º

C恒温培养12h，挑取单菌落接种至装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37º

C振荡培养12h，作为种子培养液。

2．取盛有50mL无菌牛肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶9个，分别编号为0、2、4、6、8、10、12、16、24h。

用1mL无菌吸管分别准确吸取1mL种子培养液加入已编号的8个三角瓶中，于37º

C下振荡培养。

然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放4º

C冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD600值。

3．用无菌吸头吸取1mL编号为12h的大肠杆菌培养液菌液加入盛有9mL无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中充分混匀