双分子荧光互补技术(BiFC)资料下载.pdf

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hu1purdue.eduPresentationOutlineProtein-ProteinInteractionsTheprincipleofBiFCTheApplicationsofBiFCPart1Protein-ProteinInteractions蛋白质相互作用（蛋白质相互作用（Protein-ProteinInteractions）Proteinproteininteractionsoccurwhentwoormoreproteinsbindtogether,oftentocarryouttheirbiologicalfunction.DNAreplicationSignaltransduction研究蛋白质相互作用的方法1.酵母双杂交技术（Yeasttow-hybrid）2.噬茵体展示技术（Phagedisplaytechnology）3.表面等离子共振技术（SurfacePlasmaresonancetechnique）4.荧光能量转移技术（Fluorescenceenergytransfer,FRET）5.抗体与蛋白质阵列技术（Antibodyandproteinarraytechnology）6.免疫共沉淀技术（Immunoprecipitation）7.pull-down技术（pull-downtechnology）8.双分子荧光互补（Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC）Part2TheprincipleofBiFCGFP的发光机制GFP由238个氨基酸分子组成，分子量为26.9kDa。

来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域；

来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。

GFP是典型的桶形结构，包含折叠和螺旋，将荧光基团包含在其中。

严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱导Ser65Tyr66Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。

双分子荧光互补（BiFC）荧光！

一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。

在GFP的两个片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。

BimolecularFluorescenceComplementation（BiFC）Twofragments（YNandYC）oftheyellowfluorescentprotein（YFP）arefusedtotwoputativeinteractionpartners（AandB）AninteractionbetweentheproteinsfacilitatesassociationbetweenthefragmentstoproduceabimolecularfluorescentcomplexYNandYCdonotinteractontheirownBiFC的优点（Pros）1.Relevantbiologicalcontext2.Directvisualization3.Sensitivity4.Spatialresolution5.Nospecializedequipment6.Nostructuralinformationneeded7.MultipleapplicationsBiFC的缺点（Cons）1.Real-timedetection2.IrreversibleBiFCformation3.Independentfluorescentproteinfragmentassociations4.Alteringproteinstructureandsterichindrance5.Obligateanaerobes6.Useoffusionproteins7.Temperaturedependence8.ExactinteractionrelationshipunknownBiFC系统的扩展1、MulticolorBiFC（多色双分子荧光互补）2、TriFC（三分子荧光互补）3、BiFC-FRETMulticolorBiFC

（1）Manyproteinshavealternativeinteractionpartnersineachcell,manyaremutuallyexclusiveandresultincompetitionforsharedinteractionpartnersinthecell.

（2）Basedoncomplementationbetweenfragmentsoffluorescentproteinswithdifferentspectralcharacteristics（3）Allowssimultaneousvisualizationofmultipleproteincomplexesinthesamecell（4）EnablesanalysisofthecompetitionbetweenalternativeinteractionpartnersforcomplexformationTriFCBiFC-FRETDevelopmentofaBiFC-basedFRETassay.ShyuYJetal.PNAS2008;

105:

151-1562008byNationalAcademyofSciencesThedosanddonts

（1）荧光片段和目标蛋白质之间最好加1个连接肽，以避免蛋白质空间位阻所导致的片段间不能相互靠近。

常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT,RPACKIPNDLKQKVMNH和GGGGS等；

（2）温度对片段间互补影响很大，可以有两种解决方案。

一是在室温或低于室温（25）下培养细菌或细胞，二是在生理条件下培养细菌或细胞，使融合蛋白正常表达，然后将培养物低温处理1到2h或接着于室温培养1d；

（3）建立阴性对照，以便更加确信BiFC信号反映的是蛋白质之间的相互作用。

阴性对照通常是将相互作用的蛋白进行突变，降低或缺失其相互作用能力，再采用相同策略的BiFC系统检测。

WorkflowForBiFCSelectionoffusionproteinexpressionsystemDeterminationoffusionsitesDesigninglinkersCreatingproperplasmidexpressionvectorsSelectionofappropriatecellculturesystemSelectionofappropriatecontrolsCelltransfectionVisualizationandanalysisCarefulselectionofthefluorescentproteinisimportant,asdifferentfluorescentproteinsrequiredifferentcellularenvironments.Forexample,GFPcanbeusedinE.colicells,whileYFPisusedinmammaliancells.Alinkerisashortaminoacidsequencethattethersthefluorescentreporterproteinfragmenttotheproteinofinterest,formingthefusionprotein.Whendesigningalinkersequence,onemustensurethatthelinkerissufficientlysolubleandlongtoprovidethefluorescentproteinfragmentswithflexibilityandfreedomofmovementsothatthefragmentanditspartnerfragmentwillcollidefrequentlyenoughtoreconstituteduringtheinteractionoftheirrespectivefusedproteins.Althoughitisnotdocumented,itispossiblethatthelengthorthesequenceofthelinkermayinfluencecomplementationofsomeproteins.N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheN-terminalprotein2C-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein1+N-terminalfragmentfusedattheC-terminalprotein2Whendesigningplasmidvectorstoexpresstheproteinsofinterest,theconstructmustbeabletoexpressproteinsthatareabletoformfusionproteinswithfluorescentproteinfragmentswithou