RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖凋亡的影响Word文档格式.docx

RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖凋亡的影响Word文档格式.docx

《RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖凋亡的影响Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖凋亡的影响Word文档格式.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

ABCE1基因；

转染

第一作者：

郑毛根（1966），男，博士，副主任医师，主要研究肺癌的早期诊断与治疗。

ABCE1基因是保守的ABC基因家族中最保守的基因之一，Chen等最近报道，ABCE1基因在脊椎动物的翻译起始中起重要作用，而翻译作为肿瘤的发生、发展过程中起相当重要的作用〔1〕。

近期发展起来的RNA干扰技术具有几乎无细胞毒性、稳定性强、高效特异抑制靶基因等特点，为特异地抑制目的基因表达提供了有效的方法。

本实验拟利用ABCE1特异性SiRNA表达载体转染肺癌细胞系95D，评价其对95D细胞生长的抑制作用，并评价其对增殖、凋亡相关信号转导通路表达的影响，推测ABCE1基因对肺癌细胞95D的转移、浸润能力，为利用研究ABCE1与肺癌转移的相关性提供实验依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　人肺腺癌细胞株95D购自中科院上海细胞所。

3种ABCE1基因的SiRNA质粒（Si1,Si2,SiN）均为本课题组前期实验所构建。

1640培养基、10%胎生小牛血清购于Hyclone公司。

G418（GibcoBRL）购自北京中山生物工程公司；

转染试剂FUGENE6和ELISA试剂盒购自Roche公司（USA），MTT购自Sigma公司（USA）。

细胞培养板6孔板、24孔板、96孔板购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2方法

　　1.2.1NSCLC细胞株培养

　　冻存细胞95D经复苏后，37℃、5%CO2条件下培养于含有10%胎牛血清的1640培养基（含浓度为100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素中，待80～90%细胞融合后胰酶消化传代。

经3次传代稳定后，进行如下实验。

　　1.2.2G418筛选浓度确定

　　在12孔细胞培养板中，95D细胞,按1.5×

105/孔细胞接种，加10%FBS的1640培养基1ml培养，至细胞密度达到80%～90%左右，分别加入G418（新霉素），使G418筛选浓度依次为将每孔中的G418浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100μg/ml等12个级别，培养10～14d。

每3天换液1次，维持培养孔中G418筛选浓度不变，显微镜观察细胞的生长状况，以第8～14天能杀死孔内所有细胞的G418浓度确定为筛选浓度。

　　1.2.3细胞分组及转染

　　将对数生长的细胞按2×

103浓度接种到6孔培养板中培养。

于30%～50%细胞汇合度时（处于对数生长期）准备进行转染。

实验分为4组，分别为质粒Si1转染组、质粒Si2转染组、阴性序列转染组（质粒SiN组）及空白对照组（正常细胞N组）。

转染按Roche公司非脂质体型转染试剂FuGENE6说明书操作。

前3组内质粒与FuGENE6采用1∶6比例。

48h后用含有600μg/mlG418的10%FBS培养基更换培养基，每2天更换一次，至转染后5d。

用倒置荧光显微镜（IX71,Olympus）和图像分析系统（SPOTRFKE,USA），直接观察基因沉默的效果。

　　1.2.4Western印迹法检测转染细胞中的ABCE1的蛋白的表达

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），按照《分子克隆实验指南》灌制12%不连续的SDSPAGE，分别取3组转染细胞裂解液样品（每个均取100μg细胞蛋白）加样后电泳、电转移、封闭、第1抗体结合、第2抗体结合，ECL法显影。

以βactin为内参，经凝胶分析软件分析其灰度值，结果以产物与内参照的比值表示。

　　1.2.5检测细胞生长和增殖的情况

　　收集转染48h后的3组细胞（实验组Si1,阴性对照组SiN组,空白对照组），以1×

104密度接种在12孔板中，用10%胎牛血清1640培养基，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

每2d一次更换培养基，直到转染后8d。

细胞计数用细胞计数板和倒置显微镜。

用MTT法检测细胞增殖情况（按说明书操作），酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光值（A）。

　　1.2.6组蛋白DNAELISA凋亡检测

　　收集转染后72、96、120h的上述三组细胞，按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，尽快作比色分析（10～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

　　1.3统计学分析

　　数据以x±

s表示，以SPSS11.0统计软件处理，采用方差分析作差异的显著性分析。

　　2结果

　　2.1ABCE1SiRNA质粒载体转染的效果

　　根据文献报道RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpress载体在瞬时转染中可直接用来观察构建的shRNA的对目的基因封闭的效能，该质粒载体能表达一种在荧光显微镜下可观察到红色荧光蛋白〔2〕。

显示在转染24h后在95D细胞中表达一种红色荧光蛋白，且在整个细胞中均匀分布，24h后明显,48～72h达高峰。

经流式细胞仪观察表达DsRed阳性细胞可达42.70%（图1）。

　　2.2Western印迹检测转染细胞中的ABCE1蛋白水平的表达

　　Western印迹检测结果显示,转染Si1、Si2后95D细胞ABCE1蛋白的表达量较正常组减少。

ABCE1蛋白的表达量也随着转染的时间而进一步减少,于72h达到最低（表1）。

应用BandScan图像系统分析结果所示,以95D细胞对照组的ABCE1/βactin蛋白带为标准（亮度定为100），实验组（Si1、Si2）ABCE1蛋白表达水平下移程度大于对照组（SiN）差异显著（P＜0.05），实验组间比较（Si1、Si2）无显著性差异（P＞0.05）。

表1Western印迹检测3种SiRNA质粒转染后ABCE1蛋白表达抑制情况（略）

　　2.3RNAi介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖的影响

　　与对照组相比，实验组（Si1）细胞的生长明显受到抑制差异显著（P＜0.05），而阴性对照组（SiN）与空白对照组（N）无显著性差别（P＞0.05）（表2）。

实验组（Si1）细胞在转染后48、72、96h后细胞存活率低于对照组差异显著（P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组无显著差异（P＞0.05）（表3）。

表2SiRNA质粒转染后95D细胞生长数量（略）表3SiRNA质粒转染后95D细胞存活数量（略）

　　2.4RNAi介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D凋亡的影响

　　通过ELISA法检测了3组肺癌细胞在转染48、72、96h后细胞的凋亡率,结果显示，Si1组细胞在转染后48、72、96h后细胞凋亡率高于对照组差异显著（P＜0.05），阴性对照组与空白对照组无显著差异（P＞0.05）（表4）。

表4SiRNA质粒转染后95D细胞的凋亡率（略）

　　3讨论

ABCE1基因是保守的ABC基因家族中最保守的基因之一，许多证据都表明该基因在太古代和真核生物中都起了重要的生理作用〔3〕。

ABCE1蛋白首先是由于参与了干扰素诱导的核酸酶的作用而发现的；

目前许多证据表明，ABCE1基因在翻译、HIV壳体的装配、RNaseL的抑制等都起重要的细胞学作用。

然而，RNaseL在脊椎动物以外未发现，提示ABCE1还有其他重要的功能。

有些学者报道，肺癌细胞95D的ABCE1的抑制剂能有效的肿瘤细胞的生长。

ABCE1基因作为RNaseL（核酸分解酶L）抑制剂（RLI）而被认识的，通过2～5A/RNaseL通路，能调节RNaseL的活性。

2～5A/RNaseL系统是干扰素诱导的细胞内RNA降解的核心通路，该通路在抗病毒、细胞凋亡、调节RNA稳定性及代谢方面都可能发挥着重要的作用〔4〕。

该通路有至少3种酶参与发挥作用，即2～5A合成酶、2～5A降解酶和RNaseL：

2～5A合成酶属于一个由四个干扰素诱导酶组成的酶家族，被双链RNA激活后能将ATP转换成2～5A低聚体〔5〕；

2～5A在细胞内的含量极不稳定，而2～5A降解酶负责2～5A的代谢，于2′3′末端降解它〔5〕；

2～5A依赖的RNaseL是此通路的核心酶，它的活性受细胞内极微量2～5A水平的调节，激活的RNaseL通过作用于mRNA3′端的UpNp序列，降解mRNA，从而抑制蛋白质的生物合成，除降解mRNA外，RNaseL还能黏附于18s和28s核糖体rRNA，导致核糖体失活及翻译过程的抑制〔6〕。

2～5A依赖的RNaseL途径在病毒感染时诱导被感染细胞凋亡从而发挥抗病毒的作用目前已得到多方证实〔7〕。

国外研究表明，RNaseL的活性可能分别受细胞内2～5A水平的正向调控以及ABCE1蛋白的负向调控〔8〕。

有学者发现，在某些病毒感染细胞以及细胞增殖、分化过程中，即使没有外源干扰素的参与也能观察到细胞内2～5A和2～5A合成酶含量的变化，因此认为2～5A/RNaseL通路在细胞的增殖和分化过程也可能发挥着重要且普遍的生理作用〔9〕。

关于ABCE1蛋白对RNaseL的抑制机制，Bisbal等认为可能是由于两种蛋白的直接结合形成异二聚体从而导致RNaseL失活，二者总是同时在细胞内出现，因此抑制作用与两种蛋白表达的比例有关，它们表达水平的相对平衡对于调节RNA代谢及蛋白质生物合成有重要作用〔10〕。

应用干扰素治疗将通过2～5A/RNaseL通路诱导细胞内RNaseL活性表达增加，从而促进平衡向有利于RNA降解及细胞凋亡的方向发展；

相反，在稳定转染ABCE1cDNA的细胞中RNaseL活性显著降低，凋亡途径受到抑制，细胞增殖和分化能力得到加强〔11〕。

有学者发现，在某些病毒感染细胞以及细胞增殖、分化过程中，即使没有外源干扰素的参与也能观察到细胞内2～5A和2～5A合成酶含量的变化，因此认为2～5A/RNaseL通路在细胞的增殖和分化过程也可能发挥着重要且普遍的生理作用〔12〕。

另外，Shichijo最近报道，ABCE1基因在脊椎动物的翻译起始中起重要作用，而翻译作为肿瘤的发生、发展过程中起相当重要的作用，认为ABCE1蛋白可诱导受限的HLAA2和肿瘤反应的细胞毒T细胞，可作为潜在的治疗靶基因〔8〕。

　　本研究结果显示RNAi介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D的增殖有抑制作用，同时诱导了细胞的凋亡，其作用途径可能与阻断干扰素介导的2～5A/核糖核酸分解酶L活性有关。

总之，ABCE1基因通过阻断干扰素介导的2～5A/核糖核酸分解酶L活性，在细胞抗病毒通路，抑制细胞凋亡过程，并在促进蛋白质合成及细胞增殖分化方面发挥重要作用。

总之，本结果显示RNAi介导ABCE1基因沉默能导致肺癌细胞95D增殖抑制、诱导凋亡，提示ABCE1基因可能参与了肺癌转移相关调节。

【参考文献】

1ChenZQ,DongJ,LshimuraA,etal.T