引物纯化方式选择指南Word格式文档下载.docx

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该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。

具体的反应步骤如图一。

1、脱保护基（Deblocking）

用三氯乙酸（TrichloroaceticAcid，TCA）脱去连结在CPG（ControlledPoreGlass）上的核苷酸的保护基团DMT（二甲氧基三苯甲基），获得游离的5'

-羟基端，以供下一步缩合反应。

2、活化（Activation）

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体（其3'

-端已被活化，但5'

-端仍受DMT保护），此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接（Coupling）

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'

-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4、封闭（Capping）

缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'

-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

图1:

DNA合成原理示意图（固相亚磷酰胺三酯法）

5、氧化（Oxidation）

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'

-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。

最后对其进行切割、脱保护基，合成的Oligo在脱去保护基后，目的Oligo纯度是比较低的，其中含有大量的杂质。

主要杂质有：

所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基，以及合成时产生的短链等。

以至于粗产品中全长OligoDNA含量仅为25%左右。

尽管合成时每一步的效率都在98%～99%，但累积的效率并不高。

这些杂质成分，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，还会影响下一步的反应。

因此必须对OligoDNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

基于以上合成的原理和步骤，目前，常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。

生工公司采用HAP、ULTRAPAGE、HPLC三种纯化方法，其纯化的原理及其效果分别如下，我们建议客户应根据不同的实验需求，选择合适、经济并有效的纯化方法。

1.HAP纯化方法

HAP（HighAffinityPurification）是生工生物自主开发的新型oligoDNA纯化方法。

该方法已取得国家专利（专利号：

200310208040.X）。

其原理是利用合成引物5'

-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附，而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。

HAP纯化柱中装有对DMT具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'

端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱，被洗脱。

然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。

这种方法具有多快好省的特点。

制品纯度可达到80~90%，可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途了。

但是因为其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。

特别是对长于39碱基以上的片段纯化效果不好。

此级别只提供长度在10-39mer以下的合成oligoDNA制品。

序列更长时，制品的纯度得不到保证。

若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用HAP纯化即可。

2.ULTRAPAGE纯化方法

PAGE（PolyacrylamideGelElectrophoresis），该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物（120碱基以内），从而提供高纯度的引物。

纯化后的DNA纯度大于90%，相比与其他两种方法，PAGE纯化对长链OligoDNA（大于50mer）的纯化特别有效，制品纯度保证90~95%。

如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等，请选用PAGE纯化制品。

ULTRAPAGE：

理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。

经过PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，上样量都是非常大，电泳时的条带往往比较宽，带与带之间有重叠，分辨率有所下降，电泳后割带回收目的引物时，导致割的条带有时可能比较宽，很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。

因此生工生物为了给客户更好解决以上问题，将原有的PAGE纯化方式升级优化为现在的ULTRAPAGE纯化方式，即在PAGE纯化的同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

3.HPLC纯化方法

HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography）是使用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。

合成粗产物中不同长度的DNA片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。

先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。

该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。

同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

由于HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。

主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化等。

它的优点是自动化程度高、省人力；

弱点是纯化量通量小、成本较高。

表1:

HAP、ULTRAPAGE和HPLC三种纯化方法的特点比较

纯化方式

纯化原理

优缺点

应用

HAP

采用纯化柱上特异性树脂对DNA片段上保留5'

端最后一个碱基上的DMT有亲和吸附作用从而达到分离纯化。

多快好省的特点。

纯度可达到80~90%，

但是对长于40碱基以上的片段纯化效果不好。

可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途。

ULTRAPAGE

采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，基于凝胶的尺寸和DNA的构象原理，可以分离相差一个碱基的引物，从而达到对全长产物和失败序列进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA，同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

纯度好，准确性高，对于较长序列（40-120），制品纯度保证90~95%，相比与其他两种方法，ULTRAPAGE纯化对长链引物（大于50mer）的纯化特别有效，缺点需要跑电泳并切胶回收，费时费力。

可适于多重PCR、亚克隆、点突变、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等。

HPLC

采用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。

合成粗产物中不同长度的DNA片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

该法自动化程度高、省人力；

对于较长片段（大于89mer），纯化效果不如ULTRAPAGE方法好。

尽管对于较长序列，但如果实验对制品的纯度要求非常高，HPLC与ULTRAPAGE双重精制会使效果更佳，其弱点是纯化通量小、成本较高。

因其HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。

主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化。

对40mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是ULTRAPAGE；

而对40mer以上的DNA制品ULTRAPAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。

所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择ULTRAPAGE纯化或HPLC纯化的引物。

根据不同的实验要求，您可以选用以下适合的纯化方法，具体见表2。

表2:

HAP、ULTRAPAGE和HPLC三种纯化方法的应用

引物长度要求

纯化方法要求

普通PCR/RT-PCR

<

40base

>

40base

多重PCR/定量PCR

根据实验要求定

ULTRAPAGE,HPLC

测序

诊断PCR扩增

HAP,ULTRAPAGE

亚克隆，点突变

基因构建

全基因合成

反义核酸

修饰/标记引物

PCR产物用于克隆表达研究或基因重组等

Q-1.拿到引物后，想在实验室检测纯度，如何实现？

A-1:

实验室可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物纯度的检测：

使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，碱基数≤12个的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，＞60个碱基的引物用12%的胶。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95

℃，2min）。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

（有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，是引物二级结构条带）

Q-2.测序发现引物有突变或缺失是什么原因？

A-2:

测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：

测序，PCR/克隆过程，引物本身。

A、测序引入的错误

对于PCR产物进行的克隆而言，无论是TA克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端，如果用载体引物进行测序，此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近，处于测序起始阶段或正好处于测序染料峰所在的区域内（90-120bp），这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。

因此，首先要看原始的测序峰图在引物区内是否清晰，碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚而导致的计算机误读。

B、PCR/克隆过程

尽管使用高保真聚合酶进行PCR出错的可